转染hVEGF165基因的骨髓间充质干细胞移植治疗兔心肌梗死
【关键词】 心肌梗死；,骨髓间充质干细胞；,血管内皮生长因子
【关键词】 心肌梗死；骨髓间充质干细胞；血管内皮生长因子
1 材料和方法
1.1材料
健康纯种新西兰大白兔48只，雌雄不拘，体质量2.0~2.5 kg，兔龄4~5 mo，由岭南科研动物中心提供. 低糖DMEM（Gibco产品）；Percoll分离液（Pharmacia产品）；VIII因子多克隆抗体及免疫组化检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；BrdU mAb BrdU检测试剂盒（Roche产品）；AdTrackCMVVEGF165真核表达质粒（由广东省人民中心实验室惠赠）；LipofectamineTM 2000 reagent(GIBCOL).
1.2方法
1.2.1实验分组
将兔随机分为4组（n=12），心肌梗死2 wk后在梗死区心肌梗死组（MI组）注射生理盐水； MSCs移植组（MSC组）注射107个MSCs； VEGF组注射VEGF基因（100 μg溶于200 μL PBS中）；MSCs+VEGF组（M+V组）注射107个转染VEGF基因的MSCs. 在移植前3 d进行VEGF基因转染.
1.2.2兔心肌梗死模型的建立结扎左前降支中段制作心肌梗死模型.
1.2.3兔骨髓干细胞的分离及培养于胫骨近端抽取骨髓血约4~6 mL，应用Percoll分离液(1.073 kg/L)离心提取MSCs，用含100 g/L胎牛血清的低糖DMEM 进行培养. 在细胞接近汇合时以1∶3的比例传代. 在移植前6 d用BrdU对细胞进行标记.
1.2.4pAdTrackCMV
VEGF165的制备及转染MSCs试验参照［2］的方法和说明书操作进行.
1.2.5血流动力学指标测定在移植后4 wk进行心功能测定. 经颈动脉插管至左心室，测定心率，左室平均收缩压，舒张未压，心室压，及左室压最大上升速率（+dp/dtmax）和最大下降速率（-dp/dtmax）.
1.2.6疤痕区MSCs的鉴定及计数取缝线标记区切片行BrdU免疫组化染色. ，视野内BrdU阳性染色细胞数作为MSCs数目. 切片染色后计算视野内的阳性细胞数，并取平均值作为该兔血管数目.
统计学处理： 数据采用SPSS 11.0软件进行处理，计量资料以x±s表示，组间均数比较采用t检验，计数资料以χ2检验进行比较， P<0.05为差异有统计意义.
2 结果
2.1各组兔死亡率至实验结束，共死亡兔13只. MI，MSCs，VEGF和M+V组各组死亡兔数分别为5,2,4,2只，各组间死亡率无明显统计差异. 各组兔左心室功能血流动力学变化见表1.表1各组兔左室血流动力学比较（略）
2.2梗死区MSCs的鉴定及计数心肌梗死区见BrdU阳性细胞存在. M+V组（61±8个/视野）存活的MSCs明显多于MSCs组(44±8个/视野, P<0.01).
2.3梗死区血管的数量比较MI组梗死区(18±4个/视野)明显少于VEGF组（30±8个/视野, P<0.01）；MSCs组（33±6个/视野）明显多于MI组（P<0.01）；M+V组（49±8个/视野）明显多于MSCs组（P<0.01）, VEGF组（P<0.01）和MI组（P<0.01）.
3 讨论
本研究结果表明：VEGF基因与MSCs移植结合可改善兔心肌梗死后心功能，其疗效明显优于单纯MSCs移植. 本研究中VEGF组将VEGF基因裸质粒直接注射入梗死区，发现其梗塞区有新生血管增多，但却对心功能无明显改善，这提示虽有新生血管的增生，但尚不足以改善大面积心梗后的心功能. 我们先前的实验结果表明：VEGF基因能成功转染MSCs中并获得稳定表达，表达的VEGF具有生物活性，田竞等［1］也报道了VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的成功表达. 我们在实验中进一步探讨了转染VEGF基因的MSCs移植对心梗后心功能的影响，发现其对心功能的改善明显优于单纯VEGF或MSCs移植组，在梗死区存活的MSCs和新生血管数明显增多. 说明将细胞移植和基因治疗相结合可能是治疗缺血性心脏病更佳方案. 本实验结果还显示：M+V组心功能优于MSCs组，可能的原因是缺血区血供的改善使冬眠心肌功能恢复，从而使心功能得到进一步改善.
Kloner等［2］在大鼠左室游离壁4个位点注射125 μg phVEGF165时，未见梗死面积缩小和心功能改善，注射500 μg phVEGF165时则有效. 本研究中我们将100 μg VEGF质粒注射至兔心梗区，也未能见其心功能改善. VEGF基因裸质粒治疗心肌梗死需要多大剂量才能产生疗效，多大剂量出现副作用还有待进一步探讨.
【】
［1］田竞，马保安，范清宇，等. 转染逆转录病毒的VEGF在兔骨髓基质干细胞内的表达［J］. 第四军医大学学报， 2003，24（24）：2262-2265.
［2］Kloner RA, Dow J, Chung G, et al. Intramyocardial injection of DNA encoding vascular endothelial growth factor in a myocardial infarction model ［J］. J Thromb Thrombolysis, 2000, 10(3): 285-289.
