恶性胸腔积液患者T淋巴细胞亚群的变化意义

              作者：王英禹，张瑞，张志培，周勇安，孙晓雁

【关键词】  胸腔积液；T淋巴细胞；CD4；CD8

　　Value of measurement of Tlymphocyte subsets in patients with malignant pleural effusions

　　【Abstract】 AIM: To measure Tlymphocyte subsets (TLS) in peripheral blood (PB) and pleural effusion (PE) in patients with malignant pleural effusions (MPE) and to study the changes of TLS in PB and PE in patients with MPE before and after chemotherapy. METHODS: The levels of TLS in PB and PE in patients with MPE or benign pleural effusion (BPE) and in PB of normal person were examined and compared; The levels of TLS in PB and PE were also compared before and after chemotherapy. RESULTS: The distribution of TLS was similar in PB and PE in patients with MPE; the level of CD8+ T cell in PB of patients with MPE was higher than that in normal person (30.6±2.4 vs 20.9±1.8, P<0.05), but the ratio of CD4+/CD8+ was lower than that in normal person (1.78±0.21 vs 2.71±0.35, P<0.05), and the level of CD4+ T cell was similar with the normal; compared with BPE patients, MPE ones had lower level of CD4+ T cell and ratio of CD4+/CD8+ (P<0.05), but higher level of CD8+ T cell in their PB and PE (P<0.05); chemotherapy could depress CD8+ T cell (30.6±2.4 vs 24.7±2.3, 31.6±2.4 vs 21.9±4.1, P<0.05) and elevate the ratio of CD4+/CD8+ (1.78±0.21 vs 2.19±0.19, 1.69±0.30 vs 2.62±0.40, P<0.05) in PB and PE in patients with MPE. CONCLUSION: The level of TLS in PE can be known by measuring it in PB; it is helpful to measure the level of TLS in PB and PE for distinguishing MPE from BPE; cellmediated immunity depression in MPE can be partly ameliorated by chemotherapy.

　　【Keywords】 pleural effusion； Tlymphocyte； CD4； CD8

　　【摘要】 目的：探讨检测恶性胸腔积液(MPE)患者外周血(PB)和胸水(PE)中T淋巴细胞亚群(TLS)的意义及化疗前后TLS的变化. 方法：对比良性胸腔积液(BPE)、MPE患者外周血和胸水及健康正常人外周血中TLS的水平；对比MPE患者外周血和胸水中TLS的水平；对比MPE患者化疗前、后外周血和胸水中TLS的水平. 结果：TLS在胸腔积液患者外周血和胸水中分布相似；MPE患者外周血中CD8+ T细胞水平高于正常人（30.6±2.4 vs 20.9±1.8，P<0.05），CD4+T细胞相仿，CD4+/CD8+低于正常（1.78±0.21 vs 2.71±0.35，P<0.05）；与BPE患者相比，MPE患者外周血和胸水中CD4+T细胞、CD4+/CD8+较低（P<0.05），而CD8+T细胞较高（P<0.05）；化疗后MPE患者外周血和胸水中CD8+T细胞水平明显降低（30.6±2.4 vs 24.7±2.3，31.6±2.4 vs 21.9±4.1， P<0.05），CD4+/CD8+明显升高（1.78±0.21 vs 2.19±0.19，1.69±0.30 vs 2.62±0.40，P<0.05）. 结论：检测外周血可以了解胸水中TLS水平；检测外周血和胸水中TLS水平有助于BPE和MPE的鉴别；化疗可部分改善MPE患者的细胞免疫抑制状态.

　　【关键词】 胸腔积液；T淋巴细胞；CD4；CD8

　　0引言

　　肿瘤的发生、与细胞免疫功能降低密切相关, T淋巴细胞在其中起中心调控作用［1］. 为比较良性胸腔积液（benign pleural effusion, BPE）和恶性胸腔积液(malignant pleural effusion, MPE)患者的T淋巴细胞亚群(TLS)分布水平及对原发病的诊断价值，和化疗对其影响，我们选择BPE，MPE患者的胸腔积液和外周血及正常健康人外周血进行TLS检测.

　　1对象和方法

　　1.1对象诊断明确MPE 32(男21，女11)例，平均年龄57.9岁，鳞腺癌4例，腺癌28例；BPE (结核性) 29(男17，女12)例，平均年龄45.7岁；正常对照组选自体检合格、肝、肾、肺功能完全正常健康人27(男14，女13)例，平均年龄34.2岁. 患者于前行胸腔穿刺术，收集胸腔积液，同时抽取静脉血10 mL. MP患者经NP方案化疗2个周期后（盖诺25 mg/m2 iv d1，d8；DDP 40～50 mg d1～3，21 d为一周期），收集胸腔积液，同时抽取静脉血10 mL. 采集体检正常健康人静脉血10 mL.

　　1.2方法胸腔积液用200 μm尼龙网过滤组织于离心管；加入5 mL RPMI；18℃，200 g离心10 min，去除上清液，混悬细胞沉淀于20 mL RPMI，重复离心1次，重混悬细胞沉淀于5 mL RPMI, 加入PBS冲洗细胞，室温下，200 g离心10 min，去除上清液. 重复此步骤. 混悬细胞沉淀于适量RPMI备用. 用台盼蓝计数活细胞百分率. 将肝素化的新鲜去红细胞混悬液室温下加入等量PBS混匀，每10 mL去红细胞混悬液/PBS混悬液中加入3 mL FicollHypaque液. 18℃，900 g，离心30 min. 移除上层的血浆和血小板，缓慢的转移中层的单个核细胞层到锥形管，用3倍体积的HBSS洗涤细胞，18℃，490 g，离心10 min. 去除上清液. 用HBSS重新混匀细胞、洗涤并离心1次，去除上清液. 混悬细胞于RPMI备用. 用台盼蓝计数活细胞百分率. 计数外周血和胸腔积液淋巴细胞，用RPMI调整细胞度至2.5×109/L，将l06淋巴细胞悬于100 μL Hanks缓冲液(含1 g/L牛血清蛋白、0.1 g/L叠氮钠)中，分别与20 μL抗CD3APC(UCHT1)、抗CD4FITC(RPAT4)及抗CD8Cychrome(RPAT8) mAb或相应IgG对照蛋白(均购自美国BD Pharmingen公司)于4℃孵化30 min，Hanks缓冲液洗涤2次，5 g/L多聚甲醛固定. 24 h内用FACStar Plus流式细胞仪检测CD3，CD4，CD8细胞，CD4/CD8比值.
　　
　　统计学处理：用SPSS 10.0统计软件，数据以x±sx表示. 组间比较用MannWhitney U检验. 组内前后比较用Wilcoxon signedrank检验.

　　2结果

　　2.1T细胞亚群的差异MPE患者外周血(PB)CD3+，CD8+ T细胞高于正常人对照组（P<0.05），CD4+T细胞相仿（P>0.05），CD4+/CD8+低于正常人对照组（P<0.05）；BPE患者PB CD3+，CD4+，CD8+均高于正常人对照组（P<0.05），CD4+/CD8+相仿（P>0.05）. BPE，MPE患者PB CD3+T细胞相仿（P>0.05），前者CD4+T细胞、CD4+/CD8+高于后者，而CD8+T细胞低于后者（P<0.05）. BPE，MPE中CD3+T细胞相仿（P<0.05），前者CD4+T细胞、CD4+/CD8+高于后者，而CD8+T细胞低于后者（P<0.05）. 患者外周血和PE中TLS分布相似（P>0.05）（表1）.

　　2.2化疗后TLS的变化MPE患者化疗前、后PB和PE中CD3+，CD4+T细胞无明显变化（P>0.05），而CD8+T细胞明显降低，CD4+/CD8+明显升高（P<0.05，表2）.

　　表1胸腔积液患者/正常人T细胞亚群（略）

　　表2恶性胸腔积液患者化疗后T细胞亚群变化变化（略）

　　3讨论

　　MPE患者外周血CD3+，CD8+ T细胞百分率明显高于健康人，CD4+细胞无明显差异，CD4+/CD8+比值明显低于健康人. 提示MPE CD4+/CD8+比值降低是由于CD8+细胞增高所导致，反映了MPE患者的细胞免疫功能处于抑制状态. 而BPE CD3+，CD4+，CD8+T细胞百分率均高于健康人，CD4+/CD8+比值无明显差异，反映了BPE患者的细胞免疫功能处于激活状态. 在外周血和胸腔积液中，两者的CD3+T细胞百分率相似，但MPE患者的CD4+T细胞百分率、CD4+/CD8+比值低于BPE患者，CD8+T细胞百分率高于BPE患者. 提示检测外周血或胸腔积液中TLS，有助于临床上对BPE，MPE患者的鉴别诊断. MPE患者的外周血和胸腔积液中CD3+，CD4+，CD8+ TLS百分率和CD4+/CD8+比值均相似，说明胸腔积液和外周血的分布水平非常接近，T细胞释放到外周血和分配到胸膜腔的水平有关，通过外周血TLS的检测可反映出胸腔积液T淋巴细胞水平. 化疗后CD8+T细胞明显降低，CD4+/CD8+明显升高，而CD3+，CD4+T细胞无明显变化. 提示常规化疗后肿瘤细胞大量坏死或凋亡，肿瘤负荷减少而使免疫抑制因子减少，可部分改善患者的细胞免疫抑制状态，但细胞免疫功能紊乱并未得到完全纠正.

　　CD4+ T细胞(Th)可分泌IL2，TIFN等细胞因子，并诱导或促进杀伤(NK)细胞等多种细胞毒性细胞的活性，共同发挥抗肿瘤作用［2］. CD8+ T细胞(Ts)则抑制机体的免疫功能，与肿瘤的发生、和转移密切相关. 恶性胸腔积液患者肿瘤细胞负荷增加，分泌免疫抑制因子增多，在抑制T淋巴细胞增殖、分化过程中造成Ts，Th细胞水平的增、减，以有利于肿瘤在宿主的转移［3］. 因此，细胞比值是反映细胞免疫平衡状态的敏感性指标，本研究结果提示恶性胸腔积液患者存在明显的细胞免疫功能低下、紊乱；T淋巴细胞亚群的测定对恶性胸腔积液的诊断及疗效评估有一定价值；外周血中T淋巴细胞的检测可以反映胸腔积液中T淋巴细胞分布水平. 并提示在有效化疗杀伤癌细胞的同时，应辅助以免疫调节，从而提高患者的细胞免疫功能，更有利于延长患者的生存期并改善其生存质量［4-5］.

　　【】

　　［1］ 萧剑军，何洁冰，何庭宇，等. 中晚期肺癌患者T淋巴细胞亚群和红细胞免疫功能检测及临床意义［J］. 广东医学院学报，2002，20(1)：15-16.

　　［2］ Sigstad E, Dong HP, Nielsen S, et al. Quantitative analysis of integrin expression in effusions using flow cytometric immunophenotyping［J］. Diagn Cytopathol, 2005，33(5): 325-331.

　　［3］ Chen YQ, Shi HZ, Qin XJ, et al. CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes in malignant pleural effusion［J］. Am J Respir Crit Care Med, 2005, 172(11): 1434-1439.

　　［4］ Dalbeth N, Lee YC. Lymphocytes in pleural disease［J］. Curr Opin Pulm Med， 2005，11(4): 334-339.

　　［5］ Ahmed S, Shahid RK, Rimawi R, et al. Malignant pleural effusions in lymphoproliferative disorders［J］. Leuk Lymphoma，2005，46(7): 1039-1044.