复方丹参滴丸人含药血清中丹参相关代谢产物的分析

                   作者：郑晓晖，王世祥，赵新锋，赵欣，刘青，郑建斌

【关键词】  复方丹参滴丸；含药血清；色谱法,高压液相；代谢

　　Analysis on Danshenrelated metabolites induced by Compound Danshen Dripping Pills in human serum

　　【Abstract】 AIM: To detect Danshenrelated metabolites induced by Compound Danshen Dripping Pills in human serum and elucidate the possible metabolic pathway of those metabolites. METHODS: Column switchinghigh performance liquid chromatography was used to concentrate and separate the metabolites, which were detected by electrospray ionization trap mass spectrometry. The structure of the metabolites was analyzed by multistage mass spectrometry. RESULTS: Five new metabolites were found and their possible metabolic pathways were elucidated. CONCLUSION: This work has contributed to studying the intracorporal substantial foundation of Compound Danshen Dripping Pills.

　　【Keywords】 Compound Danshen Dripping Pills; ionization; chromatography, high pressure liquid; metabolism

　　【摘要】 目的：研究复方丹参滴丸人含药血清中丹参相关代谢产物，推测其代谢机制. 方法：柱切换高效液相色谱法富集和分离血清样品中的代谢物，电喷雾离子阱质谱法进行检测，多级质谱技术确定代谢物的碎片结构，推测其结构. 结果：在人含药血清中检测到了5个新的代谢产物，分析了各代谢物的体内形成机制. 结论：本研究可为复方丹参滴丸体内物质基础的研究打下基础.

　　【关键词】 复方丹参滴丸；含药血清；色谱法，高压液相；代谢

　　0引言

　　复方丹参滴丸是根据《药典》1995年版复方丹参片的处方提取有效成分研制而成的中药滴丸剂，主要成分为丹参、三七和冰片，临床上用于胸中憋闷、心绞痛，现已被定为全国中医急诊必备中成药［1］. 丹参是复方丹参滴丸的主方药，活性成分有两大类，一类是脂溶性的二萜醌类，另一类为水溶性的酚酸类化合物. 王宁生等［2］采用LCMS法对口服复方丹参滴丸后，人含药血清中丹参相关代谢产物的分子量进行定性检测，但没能对其代谢机制进行探讨. 液相色谱离子阱质谱以其高效的分离能力和检测能力，已成为药物及其代谢物质研究的主要手段［3-7］. 我们利用LCMSn联用技术对舌下含服复方丹参滴丸后，人含药血清中丹参的相关代谢产物进行了定性分析，并初步探讨相应的代谢机制，为复方丹参滴丸中丹参的体内作用物质基础研究提供一定的.

　　1材料和方法

　　1.1材料Agilent 1100系列高效液相色谱系统（包括2套单元输液泵，VWD紫外检测器，DAD二极管阵列检测器，Agilent 4.02工作站）；Agilent 1100系列SL型离子阱质谱系统. 丹参素对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号110855200504），色谱纯乙腈（美国Fisher公司），超纯蒸馏水（自制），其他试剂均为分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1对照品溶液的制备精密称取丹参素对照品3.8 mg，用甲醇溶解至10.0 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成0.38 g/L的对照品溶液，4℃贮藏备用.

　　1.2.2空白血清供试品溶液的制备健康志愿者空腹， 取空白血清0.5 mL， 置1 mL具塞离心试管中， 加0.3 mol/L的三氯乙酸0.1 mL， 离心10.0 min （12 000 r/min）， 精密量取0.4 mL上清液置于试管中，氮气吹干，残渣用150 mL/L甲醇溶解，转入1.0 mL容量瓶中，加150 mL/L甲醇至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液，4℃贮藏备用.

　　1.2.3空白血清加药供试品溶液的制备健康志愿者空腹，取空白血清0.5 mL，加入0.5 mL药品供试品溶液，按1.2.2项下的样品制备方法制备样品，即得空白血清加药供试品溶液.

　　1.2.4含药血清供试品溶液的制备健康志愿者10名，空腹舌下含服10粒复方丹参滴丸，分别于服药后0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0 h，静脉取血4.0 mL，15 000 r/min离心10 min，制得含药血清. 取0.5 mL置1 mL具塞离心试管中，按1.2.2项下的样品制备方法制备样品，即得含药血清供试品溶液.

　　1.2.5分析条件及方法一级柱：Agilent SBC18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；二级柱：Agilent SBC18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；一级流动相为甲醇水(30∶70)，流速为0.8 mL/min；二级流动相为甲醇水甲酸铵(15∶85∶0.5)，流速为0.2 mL/min；ESI电离源；电离源模式为负离子模式；干燥气流速为7.0 L/min；雾化气压力为1815.2 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)；干燥气温度为325℃. 采用［8］方法，优化后进行样品分析. 分别取对照品溶液和3种供试品溶液，自动进样器进样10 μL，5.5 min切换，选择电喷雾负离子模式检测.

　　2结果

　　2.1丹参对照药材的ESI质谱裂解行为解析在全扫描一级质谱条件下，可获得丹参对照药材的总离子流图（图1），对总离子流图中的相对峰度大于5.0%的色谱峰进行一级全扫描分析，得准分子离子m/z 137.2［MH］-，m/z 196.8［MH］-，m/z 297.0［MH］-，m/z 309.2［MH］-，m/z 293.4［MH］-. 对这5个分子离子峰分别进行多级质谱分析，发现：m/z 137.2的二、三、四级碎片离子分别为m/z 109.1, m/z 92.8和m/z 76.9，结合原儿茶醛对照品的质谱信息，证实m/z 137.2为原儿茶醛在此分析条件的分子离子峰；m/z 196.8［MH］-的二级和三级碎片离子分别为m/z 179.5和m/z 134.4，推测碎片离子m/z 196.8为丹参素对照品的准分子离子峰；m/z 297.0的二级和三级碎片离子分别为m/z 281.7和m/z 266.6，推测m/z 297.0为隐丹参酮的分子离子峰；m/z 309.2的二级和三级碎片离子分别为m/z 278.2和m/z 263.2，推测m/z 309.2为丹参酮ⅡB分子离子峰；m/z 293.4的二级和三级碎片离子分别为m/z 278.2和m/z 261.2，推测m/z 293.4为丹参酮ⅡA在此分析条件下形成的分子离子峰.

　　图1丹参对照药材供试品溶液总离子流　略

　　2.2血清供试品溶液的分析根据1.2.5项下的分析条件，对空白血清、空白血清加药和含药血清供试品溶液进行分析，得总离子流图（图2）. 通过对比分析，排除了内源性成分的干扰，发现峰1，2，3，4和5为新出现的色谱峰，对应的分子离子峰为m/z 109.4，m/z 166.9，m/z 239.2，m/z 278.2，m/z 377.1，推测其为原药中丹参相关成分的特征代谢产物.

　　图2血清样品总离子流　略

　　2.3特征代谢产物质谱分析

　　2.3.1碎片离子m/z 109.4和m/z 166.9的多级质谱分析选m/z 109.4为母离子进行MS2和MS3分析，得到的主要碎片依次为m/z 93.6和m/z 76.6，推测m/z 109.4为原儿茶醛在人体内的代谢物儿茶酚，其产生机制和ESI裂解路线如图3.

　　图3特征代谢物m/z 109.4产生机制及裂解路线图　略

　　选m/z 166.9为母离子进行质谱分析，其二级质谱碎片离子主要为m/z 122.8，再进行裂解碎片的多级质谱分析时，各级质谱相应丰度较大的碎片依次为m/z 122.8, m/z 92.7, m/z 76.8，由香草酸对照品的质谱信息获知该化合物为香草酸，推测其为原儿茶醛在体内的另一个代谢物，其产生机制和ESI裂解路线如图4.

　　图4特征代谢物m/z 166.9产生机制及裂解路线图　略

　　2.3.2碎片离子m/z 239.2的多级质谱分析选m/z 239.2为母离子进行二级质谱分析，获得的碎片离子为m/z 223.4，再进行多级质谱分析时发现，该离子是按照如下过程进行裂解：m/z 239.2→m/z 223.4→m/z 137.6→m/z 120.1 →m/z 104.2→m/z 76.2，推测m/z 239.2为丹参素在体内的主要代谢产物β(3,4二羟基苯基）α羟基丙酸异丙酯，其产生机制和ESI裂解路线如图5.

　　图5特征代谢物m/z 239.2产生机制及裂解路线图　略

　　2.3.3碎片离子m/z 278.2的多级质谱分析选择m/z 278.2为母离子进行MS2分析，得主要碎片离子m/z 263.3和m/z 250.2，结合丹参酮ⅡB的多级质谱信息，推测m/z 278.2为丹参酮ⅡB在体内的主要代谢产物，产生机制和ESI裂解路线如图6.

　　图6特征代谢物m/z 278.2产生机制及裂解行为路线图　略

　　2.3.4碎片离子m/z 377.1的多级质谱分析选择m/z 377.1为母离子进行MS2分析，得主要碎片离子m/z 182.2和m/z 152.8. 再分别进行MS3分析，则均形成碎片离子m/z 92.6，推测m/z 377.1为丹参素在UDPβ葡萄糖醛酸转移酶作用下在体内的主要代谢产物，产生机制和ESI裂解路线如图7.

　　图7特征代谢物形m/z 377.1产生机制及裂解行为路线图　略

　　3讨论

　　对该含药血清的质谱分析结果显示，丹参素在酸性条件下易形成不稳定的二聚体结构，在体内易被酯化形成β(3,4二羟基苯基)α羟基丙酸异丙酯，或者与体内葡萄糖醛酸结合形成酯型葡萄糖苷酸；原儿茶醛在体内易被氧化为原儿茶酸，该酸在体内易脱羧形成儿茶酚，或甲基化形成香草酸；丹参酮ⅡB在体内易失去羟甲基.

　　目前对代谢物的研究主要集中在对中药单体成分的代谢化学研究，对中药材及其中药复方的代谢化学研究还处于起步阶段，报道的还很少. 我们采用CSHPLCESIMSn联用技术对复方丹参滴丸中丹参在人体内的相关代谢产物进行研究，可为丹参在其他体液或组织中代谢产物的研究提供方法学.

　　【参考文献】

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