siRNA干扰ADAR1表达对小鼠混合淋巴细胞培养的影响

                             作者：蔡磊，霍斌亮，张巍，张福琴，赵青川

【关键词】  淋巴细胞培养试验,混合；RNA干扰；ADAR1基因；siRNA；排斥反应

　　Effect of siRNAmediated  silencing of ADAR1 gene on mixed mouse lymphocyte culture

　　【Abstract】 AIM: To investigate lymphocyte proliferation when ADAR1 is suppressed in mixed lymphocyte culture test. METHODS: Primary lymphocyte was isolated from Balb/c and C57 mice. ADAR1 siRNA was transferred into the lymphocyte cell using Lipofectamine 2000 before twosource lymphocytes were mixed and cultured. The cell morphology was observed under a light microscope, the cell proliferation was checked using cell counting, trypan blue staining and the cell viability was determined by MTT assay. The ADAR1 mRNA was detected by RTPCR. RESULTS: When the ADAR1 expression was suppressed by the specific siRNA, the lymphocyte proliferation was inhibited in mixed lymphocyte culture test. CONCLUSION: ADAR1 has a potential role in the  proliferation of mouse lymphocyte.

　　【Keywords】 lymphocyte culture test, mixed; RNAi; ADAR1; siRNA; rejection

　　【摘要】 目的: 研究靶向ADAR1基因的siRNA在小鼠双向混合淋巴细胞培养中所扮演的角色. 方法：将化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA在Lipofectamine 2000介导下转染处于双向混合淋巴细胞培养试验中的小鼠淋巴细胞，观察转染组与未转染组细胞表型的变化；通过RTPCR检测两组细胞中ADAR1 mRNA的变化；细胞计数和台盼蓝拒染法检测靶向ADAR1基因的siRNA对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法评价转染化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA后对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用. 结果： 在经典淋巴细胞混合培养试验中，转染靶向ADAR1基因的siRNA可以明显降低小鼠淋巴细胞内ADAR1的表达，同时ADAR1siRNA对小鼠淋巴细胞的增殖有抑制作用. 结论：在经典淋巴细胞混合培养试验中,化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA能有效抑制ADAR1基因在小鼠淋巴细胞中的表达，并对小鼠淋巴细胞增殖有抑制作用.

　　【关键词】 淋巴细胞培养试验，混合；RNA干扰；ADAR1基因；siRNA；排斥反应

　　0引言

　　RNA编辑是近年来分子生物学领域研究的热点［1-2］. RNA编辑酶ADAR1是一种RNA依赖性腺嘌呤脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA, ADAR)，它以脱氨的方式对RNA中的核苷酸起转化或修饰作用，使RNA特异位点腺嘌呤核苷变为次黄嘌呤核苷，进而改变遗传密码，使编码的蛋白质结构和功能也发生改变. RNA干扰技术(RNA interfering, RNAi)是近年来研究基因表达调控的新技术，其机制是将序列特异性双链RNA导入有机体，使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性沉默. 我们应用RNAi技术借助混合淋巴细胞培养试验模型研究靶向ADAR1的siRNA对小鼠淋巴细胞功能的影响,为器官移植术后急性排斥反应的提供新的治疗手段.

　　1材料和方法

　　1.1材料Balb/c小鼠及C57小鼠各4只，雄性，18~25 g（第四军医大学实验动物中心），淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）， DMEM培养基（Gibco公司）, Lipofectamine （Invitrogen公司），化学合成的ADAR1SiRNA片段由广州锐博生物科技有限公司提供,反转录试剂盒和PCR试剂（TOYOBO公司），ADAR1及GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成. Mastercylerep型PCR扩增仪（Eppendorf公司），EPS 2A200型电泳仪（Amersham Biosciences公司号），凝胶成像系统为上海复日科技有限公司FR200全自动紫外与可见分析装置，550型酶联免疫检测仪（BIORAD公司）号，1100 pro型分光光度仪（Ultrospec公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1siRNA的设计和配制及引物的合成选定ADAR1基因（GENEBANK编号： NM_019655）的1824～1842处作为靶序列，设计siRNA序列为：正义链 5′ CCAGUACUGUGUAGCAGUA dTdT 3′，反义链 3′ dTdT GGUCAUGACACAUCGUCAU 5′. 内参照引物和ADAR1基因PCR扩增产物设计与合成. 根据GenBank上发表的GAPDH和ADAR1序列,利用Primer Premier 5.0软件设计可以扩增的引物： GAPDH上游引物为5′ CATCACTGCCACCCAGAAGA 3′,下游引物为5′ TGAAGTCGCAGGAGACAACC  3′,扩增片段长度为320 bp；ADAR1基因上游引物为5′ CCTGTCAGCGGGTTGTTAGAGTA 3′，下游引物为5′ TGGGAGCCATAGATTCATCAAGT  3′, 扩增片段长度为610 bp.

　　1.2.2小鼠淋巴细胞的分离及siRNA转染细胞将小鼠断头处死，无菌条件下取出脾组织，用Dhanks液冲洗1次，用含青霉素、链霉素的双抗溶液冲洗1次，在器皿中磨碎后由不锈钢纱网过滤，将过滤得到的液体以1∶1的比例与淋巴细胞分离液混合，2500 r/min离心25 min后液体分为3层，取中间云雾状细胞层，Dhanks液洗2遍，将细胞重悬于含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基中，计数后混合两种小鼠的淋巴细胞,调整细胞数为1.7×109/L. 在6孔板中将细胞分为3组:转染ADAR1siRNA组、转染Lipofectamine组、正常未转染组，在37℃，50 mL/L CO2的条件下孵育. 按Lipofectamine及siRNA说明书操作转染细胞，siRNA终浓度为50 nmol/L，以转染Lipofectamine及正常混合培养的淋巴细胞作为对照.

　　1.2.3RTPCR检测ADAR1 mRNA的表达用Trizol试剂提取转染后48 h三组细胞中的总RNA，分别将RNA 2 μL、随机六聚体1 μL、 去离子水9 μL, MMLV反转录反应缓冲液4 μL, RNasin 1 μL, dNTPs 2 μL和MMLV 1 μL依次加入反应管中,按反转录试剂盒说明书进行反转录. 分别取反转录产物2 μL, 10×PCR反应缓冲液5 μL, dNTPs 1 μL,上下游引物各1.25 μL,Taq酶0.5 μL,加去离子水补足至25 μL,在PCR扩增仪中进行反应,反应条件为94℃预变性4 min；95℃变性15 s；58.7℃退火1 min；72℃延伸2 min，35个循环. 同时，用PCR扩增管家基因GAPDH作为检验反转录是否成功的标准. 各取5 μL PCR产物做10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察.

　　1.2.4小鼠淋巴细胞增殖变化的检测收集混合培养的小鼠淋巴细胞，洗涤后重悬于含100 mL/L小牛血清、无抗生素的DMEM培养液中，接种于96孔培养板，使细胞密度为1.75×109/L，体积200 μL，转染后在37℃，50 mL/L CO2的条件下孵育. 每组设置转染后24，48，72 h共3个时间点，每个时间点设置6个平行孔，空白对照组用DMEM培养基补足. 在每个时间点取4孔加入5 g/L MTT 20 μL，37℃，50 mL/L CO2继续孵育4 h,离心后弃上清，加入二甲基亚砜150 μL，振荡5 min，在酶联免疫检测仪上检测. 另在每个时间点设置2孔在倒置显微镜下观察计数，并取部分细胞悬液以4 mL/L台盼蓝染色计数.

　　统计学处理：所有数据均以x±s表示. 将原始数据输入SPSS 11.0统计软件包，不同处理组组间比较运用KruskalWallis H法和Nemenyi法检验. 显著性水平均为0.05.

　　2结果

　　2.1ADAR1 siRNA转染对ADAR1 mRNA水平的影响转染ADAR1siRNA组48 h后的小鼠淋巴细胞出现ADAR1 mRNA水平下调，与转染及正常未转染组比较条带亮度降低(图1).

　　图1ADAR1表达产物电泳图　略

　　2.2ADAR1 siRNA转染对小鼠淋巴细胞增殖的影响①倒置显微镜下观察到转染ADAR1siRNA 48 h后,小鼠淋巴细胞皱缩,活力下降(图2). ②细胞计数发现,正常未转染组细胞数［(164.0±1.2)×107/L］稍有下降,转染Lipofectamine组细胞［(159.0±3.4)×107/L］数量下降,而转染ADAR1siRNA组细胞数量［(149.0±1.8)×107/L］明显下降且下降的幅度快于正常未转染组及转染Lipofectamine组(P<0.01, 图3). ③台盼蓝染色后发现,正常未转染组死亡细胞数目［(5.0±2.0)×107/L］较少, 转染Lipofectamine组死亡细胞数目［(9.0±2.8)×107/L］较多,而转染ADAR1siRNA组死亡细胞数量［(14.0±3.5)×107/L］明显多且死亡细胞增长的幅度快于正常未转染组及转染Lipofectamine组(P<0.01, 图4). ④MTT结果显示, 降低ADAR1表达后淋巴细胞接受抗原刺激后活化及增殖能力减弱(P<0.01, 图5).A: 正常未转染组的小鼠淋巴细胞；B: 转染Lipofectamine组的小鼠淋巴细胞；C: 转染ADAR1siRNA组的小鼠淋巴细胞.

　　图2－图5　略

　　3讨论

　　混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture，MLC)是一种测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容程度的试验方法,常用于器官移植前的组织配型.
  
　　RNA编辑是指DNA转录成前RNA(preRNA)后RNA序列内一些特异位点的核苷酸发生删除、添加或修饰等变化. 这些变化改变了遗传信息使得一个基因产生几种结构和功能不同的蛋白质. 对RNA发生编辑作用的酶称为RNA编辑酶,有三组家族成员,研究最广泛者是ADAR1［3-5］ (RNA依赖性腺嘌呤脱氨酶,adenosine deaminase acting on RNA). ADAR1使preRNA中特定位点的腺嘌呤脱氨转换成次黄嘌呤，改变了遗传密码，造成其所编码的蛋白质结构和功能发生改变. 有关RNA编辑在免疫应答中的作用研究目前刚刚起步. 罗晓星等［6］发现，重症感染的小鼠肝、脾、胰、淋巴结和胸腺中ADAR1表达显著升高，提示ADAR1在炎症和免疫系统中发挥着重要作用. Yang等［7］报道内毒素、白介素和TNFα均可诱导T淋巴细胞巨噬细胞等表达ADAR1. Zhao等［8］发现，小鼠原代淋巴细胞增殖过程中，ADAR1表达活性也是显著升高的. 我们的研究发现： ①大鼠肝移植出现排斥反应时,脾和肝细胞内ADAR1表达升高3~5倍；应用FK506预防后，ADAR1表达升高的幅度明显降低. ②将绵羊红细胞注入C57/BL6小鼠腹腔,发现胸腺、脾脏和淋巴结内ADAR1的活性显著升高. 而同品系小鼠之间输入全血成分,ADAR1的变化也不明显. ③在淋巴细胞杀伤试验中，用siRNA质粒抑制ADAR1表达后，淋巴细胞对靶细胞的杀伤功能明显减低［9-10］. ④ 淋巴细胞内ADAR1活性与IL2密切相关.原代培养的淋巴细胞只有在加入了IL2后活性才升高［11］. 用IL2依赖性T淋巴细胞CTLL2做试验，发现ADAR1低活性的细胞株凋亡比例明显高于正常的CTLL2细胞. 且IL2的依赖程度、ADAR1活性以及细胞增殖速度，三者成正相关［12］. 上述结果提示,在器官移植排斥反应过程中ADAR1可能发挥着重要的作用.
  
　　我们借助RNAi技术在经典的双向淋巴细胞混合培养试验中观察了ADAR1表达降低后对小鼠淋巴细胞功能的影响，发现抑制了ADAR1表达后，①小鼠淋巴细胞ADAR1 mRNA水平下调，与转染及正常未转染组比较条带亮度降低，说明转染ADAR1siRNA后可以对ADAR1 mRNA水平产生影响,而传染Lipofectamine 后,对小鼠淋巴细中的ADAR1 mRNA水平未产生影响；②存活淋巴细胞数目显著下降（P<0.01），而死亡细胞数目显著增多（P<0.01），且MTT结果与之相符（P<0.01），结果提示ADAR1 mRNA的表达水平受到明显抑制，淋巴细胞受到抗原刺激后其活化、增殖的速度减慢，能力减弱；正常未转染ADAR1siRNA组ADAR1的表达没有明显变化，淋巴细胞受到抗原刺激后其活化、增殖的速度没有明显变化. 说明ADAR1与淋巴细胞接受抗原刺激后活化及增殖的能力密切相关，且靶向ADAR1的siRNA产生了序列特异性效果，能够抑制小鼠淋巴细胞的增殖.

　　【】

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