NK细胞对小鼠H

                           作者：张梅,吴迪，徐汇,贺鹏程，李静，习杰英，蔡瑞波，刘亚琳

【关键词】  杀伤细胞,天然;,骨髓移植;,移植物抗宿主病;,造血重建

　　Effect of NK cell on GVHD and hematopoietic reconstitution after H2 haploidentical bone marrow transplantation in mice

　　【Abstract】 AIM: To explore the effect of natural killer (NK) cell on graftversushost disease (GVHD) and hematopoietic reconstitution after H2 haploidentical bone marrow transplantation in mice. METHODS: Murine model of H2 haplotype mismatched bone marrow transplantation was established by using Balb/c (H2d) mouse as recipient, and Balb/c (H2d)×C57BL/6(H2b)(H2d/b) mouse as donor. Lethally irradiated Balb/c (H2d) mice were transplanted with Balb/c (H2d)×C57BL/6(H2b)(H2d/b) bone marrow plus with donor peripheral T cells and/or NK cells. GVHD and hematopoietic reconstitution were observed and evaluated by clinical manifestations, pathological changes and WBC counting. RESULTS: In the bone marrow plus with T cells group, GVHD was induced in 90% mice and the recovery of the WBC needed 4 weeks averagely; but in the group plus with low concentration of NK cells, GVHD was induced in 20% mice and the recovery of the WBC was 3 weeks averagely; and in the group transplanted with high concentration of NK cells, GVHD was induced only in 10% mice and the recovery of the WBC was 3 weeks averagely. Compared with the group transplanted only with T cells, the incidences of GVHD in the later two groups decreased obviously (P<0.01), and the recovery of the WBC was in a shorter time (P<0.01). CONCLUSION: In mouse H2 haploidentical bone marrow transplantation, alloreactive NK cells can reduce the incidence of GVHD and promote  hematopoietic reconstitution.

　　【Keywords】 killer cell, natural; bone marrow transplantation; graftversushost disease;  hematopoietic reconstitution

　　【摘要】 目的: 研究杀伤(NK)细胞在单倍体相合骨髓移植中对移植物抗宿主病(GVHD)及造血重建的影响. 方法: 以近交系Balb/c（H2d）×C57BL/6（H2b）杂交F1代小鼠（H2d/b）为供鼠、Balb/c（H2d）为受鼠,在移植物中增加供者的外周T细胞和(或)NK细胞进行半相合骨髓移植，根据临床表现、病理检查及外周血白细胞(WBC)数,比较不同移植组GVHD发生及造血重建情况. 结果: 骨髓+T细胞组中90%的小鼠出现GVHD，外周血WBC平均在移植后4 wk恢复正常；而骨髓+T+低浓度NK细胞组中20%小鼠出现GVHD, 外周血WBC平均在移植后3 wk恢复正常；骨髓+T+高浓度NK细胞组中仅10%出现GVHD，外周血WBC也平均在移植后3 wk恢复正常. 后两组较骨髓+T细胞组GVHD发生率显著下降(P<0.01),外周血WBC恢复时间显著提前(P<0.01). 结论:在小鼠单倍体相合骨髓移植中,同种反应性NK细胞可降低GVHD发生率,促进造血重建.

　　【关键词】 杀伤细胞,天然; 骨髓移植; 移植物抗宿主病; 造血重建

　　0引言

　　异基因造血干细胞移植(alloHSCT)是目前治愈恶性血液病的最有效手段. 理想的供者是人类白细胞抗原(HLA)相合的血源相关或无关供者,但前者的概率仅有25%～30%,后者的概率约为1/10万, 故供者来源的严重不足是限制alloHSCT的巨大障碍［1］. 与HLA完全相合HSCT比较, HLA单倍体相合移植难题之一是严重的移植物抗宿主病（GVHD）及移植后造血重建的延迟. 近年研究表明, NK细胞能够通过直接和间接的方式调节造血功能，并通过特异性杀伤宿主的抗原提呈细胞（APC）,降低GVHD发生率［2-3］. 本研究我们将供者NK细胞作为预处理方案的组成部分,在Balb/c（H2d）×C57BL/6（H2b）杂交F1代小鼠（H2d/b）移植给Balb/c（H2d）小鼠模型上,观察移植前输注供者NK细胞对单倍体相合骨髓移植后GVHD及造血重建的影响,借此评价其在单倍体相合HSCT中的免疫调节作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料移植受鼠为Balb/c (H2d)小鼠,雌性, 8～10周龄,体质量18～22 g;移植供鼠为Balb/c（H2d）×C57BL/6（H2b）杂交F1代小鼠（H2d/b）,雄性, 8～10周龄,体质量18～22 g. 上述均购于第四军医大学实验动物中心. 按移植物的不同分为5组,每组10只,所有受鼠均未给予GVHD防治措施. ① 单纯照射组: 照射后4 h输注RPMI 1640液0.2 mL/只;② 骨髓细胞组: 照射后4 h经尾静脉移植供鼠骨髓细胞1×107/只; ③ 骨髓+T细胞组: 照射后4 h移植供鼠骨髓细胞1×107 +T细胞2×107/只; ④骨髓+T+低浓度NK细胞组: 照射后1 h内移植供鼠NK细胞0.5×106/只,4 h后,移植供鼠骨髓细胞1×107 +T细胞2×107/只; ⑤ 骨髓+T+高浓度NK细胞组: 照射后1 h内移植供鼠NK细胞1×106/只,4 h后,移植供鼠骨髓细胞1×107+T细胞2×107/只.

　　1.2方法

　　1.2.1受鼠准备全部受鼠在移植前5 d开始饮用含庆大霉素(32万U/L)+红霉素(250 mg/L)的灭菌水,移植前4 h予60Co γ射线全身照射(TBI),总剂量8.5 Gy,剂量率0.5 Gy/min.

　　1.2.2供鼠骨髓与脾细胞的制备颈椎脱臼法处死30只H2d/b供鼠, 无菌分离股骨、胫骨与脾脏. 剪去股骨与胫骨的骨骺端,用RPMI 1640液反复冲洗骨髓腔，0.83％ NH4Cl裂解红细胞后，用RPMI 1640洗涤2次,调整细胞数为1×108/mL备用;脾脏于200目筛网上研磨滤过收集脾单个核细胞悬液,用0.83％ NH4Cl裂解红细胞后,RPMI 1640洗涤2次(作为T细胞),调整细胞数为1×108/mL备用.

　　1.2.3供鼠NK细胞的分离选择H2d/b小鼠脾细胞悬液为H2单倍体相合NK细胞的来源,无菌条件下分离20只H2d/b小鼠脾脏,用200目筛网研磨收集细胞悬液, 400目筛网过滤后制成脾单核细胞悬液,用0.83％ NH4Cl裂解红细胞,计数细胞数,调整细胞浓度为1×107个细胞/90 μL缓冲液(磷酸盐缓冲液,pH 7.2),按每107个细胞加入10 μL抗NK细胞免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司产品), 4~8℃孵育15 min后，用MiniMACS分选仪(MiltenyiBiotec公司产品)分选NK细胞,调整细胞数为5×106/mL备用.统计学处理： 应用SPSS 10.0统计包处理数据,多样本间均数比较用方差分析,率的比较用χ2检验. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1临床及病理表现单纯照射组均无脱毛、弓背体位、腹泻等GVHD的临床表现,移植后精神萎靡,体质量逐渐减轻,全部在2 wk内死亡. 肝、小肠和皮肤病理检查未见异常. 骨髓细胞组移植后均无弓背体位、腹泻、脱毛等GVHD的临床表现,移植后初期有精神不振、体质量减轻,但2 wk后逐渐恢复活泼好动的习性,体质量亦恢复正常,存活均超过60 d. 人为处死取其肝脏、小肠和皮肤进行病理检查,未见GVHD病理改变. 骨髓+T细胞组在移植后10 d开始出现典型少食、少动、体质量减轻、弓背体位、毛发紊乱无光泽和腹泻等急性GVHD (aGVHD)症状,死亡高峰在15～30 d,肝、小肠和皮肤病理改变符合典型的GVHD改变(图1A,B,C). 骨髓+T+低浓度NK细胞组于移植后28～40 d开始出现弓背体位、 腹泻等GVHD表现, 其小鼠肝、 小肠和皮肤的病理表现符合中度GVHD改变. 骨髓+T+高浓度NK细胞组仅10%(1/10)小鼠在移植后42 d出现弓背体位, 其小鼠肝、 小肠和皮肤的病理表现符合轻度GVHD改变.

　　图1骨髓＋T细胞移植小鼠GVHD的病理改变HE ×200　略

　　2.2造血重建单纯照射组外周血WBC进行性下降, 全部在2 wk内死亡, 死亡时外周血WBC接近于0. 骨髓+T+低浓度NK细胞组及骨髓+T+高浓度NK细胞组的外周血WBC在移植后7，14，21，28 d明显高于骨髓+T细胞组(P<0.01), 两个NK细胞剂量组之间比较差异无显著性(P>0. 05). 骨髓+T+低浓度NK细胞组及骨髓+T+高浓度NK细胞组均在第3周恢复正常造血,而骨髓+T细胞组在第四周恢复正常造血（表1）.

　　单纯照射组10只小鼠于照射后12 d开始死亡,14 d内全部死亡,生存时间为（12.86±0.42） d; 骨髓细胞组60 d内全部存活,存活率100％; 骨髓+T+低浓度NK细胞组及骨髓+T+高浓度NK细胞组在15，30，45，60 d明显高于骨髓+T细胞组(P<0.01), 两个NK细胞剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05,表2）.
　
　　表1小鼠移植后外周血WBC变化(略）

　　表2小鼠移植后存活率［略］

　　3讨论

　　NK细胞通过释放细胞因子及细胞毒作用而抵御外源性致病菌感染及肿瘤的发生,人类NK细胞约占外周血淋巴细胞的5%～15%. NK细胞通过识别主要组织相容性抗原（MHC）I类分子而保护正常的细胞免受自身NK细胞的攻击,维持自身耐受，而MHC I类分子下调的靶细胞,如病毒感染细胞或转化的肿瘤细胞对NK细胞的杀伤十分敏感［4］. 在单倍体相合骨髓移植中,如果受者缺乏供者的某一种杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)的配体(移植物抗宿主方向的KIR配体不匹配)，受者的MHC I类分子不能阻止NK细胞的异体反应,就会被NK细胞杀伤，此为NK细胞的同种反应性.
    
　　本文采用Balb/c（H2d）×C57BL/6（H2b）杂交F1代小鼠（H2d/b）移植给Balb/c（H2d）是国内外研究MHC单倍体相合HSCT常用的动物模型,具有实用性和代表性. 供者的NK细胞不表达H2d特异性的Ly49A/G2受体,而表达Ly49C/I受体,因此供受者NK细胞的KIR不相合. 单纯照射组照射剂量是致死性的, 而骨髓细胞组移植后60 d内全部存活.  分析原因可能与同种反应性NK细胞通过特异性杀伤宿主APC阻止了GVHD的启动有关［5-6］. 此外，增加NK细胞的小鼠移植后外周血白细胞恢复较骨髓细胞组及骨髓+ T细胞组速度快、程度高，提示同种反应性NK细胞还有促进造血重建的功能. 我们推测同种反应性NK细胞促进造血重建的可能机制为: ①供者NK细胞通过免疫调节,抑制和消除宿主的NK细胞及对照射抵抗的T细胞对供者骨髓造血细胞的排斥反应,有利于供鼠骨髓在宿主体内的更多植入［7］; ②NK细胞在全血细胞减少的病理状况下,发挥其正向造血调控作用,释放造血生长因子,以保持造血的平衡［8］; ③在本实验中, 保留了供者骨髓移植物中的T细胞,使其促进供者造血细胞植入的功能得以发挥［8］.
    
　　采用免疫磁珠阳性标记分离NK细胞可以做到方便、快捷、无污染、高纯度、高活性, 因此将分离到的供者NK细胞加入到预处理方案中具有一定的临床可行性. 本实验为移植预处理加入NK细胞以期解决MHC单倍体相合骨髓移植GVHD重及移植后造血重建延迟提供了一定的理论与实验基础.

　　【】

　　［1］ 白海,欧英贤,王存邦,等. 异基因外周造血干细胞移植急慢性白血病 ［J ］. 第四军医大学学报, 2002, 23(7): 659-661.

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