PTD

                                        作者：邱波，马庆久，鲁建国，阴继凯，李金茂，王青

【关键词】  SH2基因;,融合蛋白；表达；纯化；pET

　　Prokaryotic expression and purification of PTDSH2 fusion protein

　　【Abstract】 AIM: To construct the recombinant expression vector containing protein transduction domain （PTD） and Src homology 2 （SH2） fusion gene and express PTDSH2 fusion protein in E. coli and purify the fusion protein. METHODS: A 297 bp of human SH2 gene fragment was amplified by PCR and subcloned into pET16b vector downstream of the PTD fragment, an E.coli expression vector, to construct a recombinant plasmid pET16bPTDSH2. The plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced to express fusion protein PTDSH2 with IPTG. The expression of PTDSH2 was detected by SDSPAGE and Western blot. The expressed protein was purified by NiNTA affinity chromatographic column. RESULTS: SH2 was identical to what reported by GenBank. A novel protein with expected molecular mass (about Mr 15×103) was expressed under the induction with IPTG. The expressed product showed good reactivity to antiHis tag antibody, and was mostly in the form of inclusion bodies. The expressed proteins could be purified via NiNTA affinity chromatography in denatured condition. CONCLUSION: Our successful construction of recombinant express vector pET16bPTDSH2 and efficient expression of PTDSH2 fusion protein in E. coli and purification of interest protein lay a basis for further study on SH2 functions.

　　【Keywords】 SH2; fusion proteins; expression; purification; pET16b vector

　　【摘要】 目的：构建含SH2与蛋白转导结构域(PTD)融合基因片段的重组表达载体，在大肠杆菌中进行表达并纯化蛋白. 方法: 通过PCR方法扩增出SH2基因，克隆入pMD18T载体，进行测序分析，将该基因亚克隆入原核表达载体pET16b中PTD 的下游构建重组质粒pET16bPTDSH2,转化感受态细胞BL21(DE3)，经IPTG诱导表达重组融合蛋白，对表达产物进行SDSPAGE电泳和Western blot检测分析，将已表达的蛋白质通过NiNTA亲和色谱柱进行纯化. 结果:构建了重组融合表达质粒pET16bPTDSH2, 表达的融合蛋白经SDSPAGE分析，在约Mr为15×103处出现了一条新生的蛋白条带，经灰度扫描检测，表达量约占菌体总蛋白的16%, 可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在，纯化后得到了目的蛋白. 结论: 成功构建了PTDSH2的重组表达载体，使融合蛋白在E. coli DE3中高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白，为后续的SH2结构域的功能研究奠定了基础.

　　【关键词】 SH2基因; 融合蛋白；表达；纯化；pET16b载体

　　0引言

　　目前许多研究表明酪氨酸激酶（PTKs）的过表达及其诱导的异常增值信号转导与肝癌发生有着明显的相关性［1］. SH2结构域，作为一种广泛存在于PTKs中的参与信号转导的蛋白结合结构域，已成为新的干预恶性肿瘤异常信号转导途径的靶位点. 蛋白转导结构域(protein transduction domain, PTD) 与其他蛋白融合表达, 可以使生物大分子以非受体依赖方式进入细胞, 而且具有转导速度快、效率高的特点［2］. 我们克隆并表达全长融合基因PTDSH2，在SH2的5′端融合PTD后在E. coli DE3中高效表达并纯化蛋白，为后续的以SH2结构域为靶位点的肝癌基因方法奠定了实验基础.

　　1材料和方法

　　1．1材料大肠杆菌DH5α, BL21等感受态细胞为本校微生物教研室保存，质粒pET16bPTDCre为唐都血液科室构建并惠赠，携带有33个碱基的PTD片段［3］. NiNTA Purification System（美国Invitrogen公司）；限制性内切酶BamHI和XhoI, 载体PMD18T, Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶（大连Takara公司）；异丙基硫化βD半乳糖苷(IPTG)（美国Sigma公司）；质粒提取盒、胶回收试剂盒（美国Omega公司）；标准分子量蛋白marker（立陶宛MBI公司）硝酸纤维素(NC)膜（美国Millipore公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1SH2基因片断的扩增根据GenBank中人类酪氨酸激酶Src蛋白的SH2基因序列设计引物， 上游P1： 5′TTTCTCGAGGAGTGGTATTTTGGCAAGATCAC3′含XhoI酶切位点；下游P2：5′TTTGGATCCTCAGCACACGGTGGTGAGGC3′含BamH I酶切位点. 模板为人类肝组织的cDNA文库. PCR产物经18 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果. 经电泳回收约297 bp片段，用胶回收试剂盒回收纯化后，用T4 DNA连接酶连接，克隆入载体PMD18T中. 16℃下经16 h连接反应后，转化感受态大肠杆菌DH5α，经16～18 h转化后随机挑取单克隆4个，在含有氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养基中37℃温箱振摇培养过夜. 增菌后碱裂解法提取质粒DNA，用BamH I和Xho I双酶切后进行电泳鉴定，以DL2000为分子大小参照，观察有无约300 bp大小的片段，然后随机挑取2个阳性克隆进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18TSH2.

　　1.2.2重组质粒的构建和鉴定将质粒pMD18TSH2和pET16bPTDCre分别用BamH I和Xho I进行双酶切，将从pMD18TSH2所获得的小片段与从pET16bPTDCre所获得的大片段(Cre片段被切除)相连接，得到重组融合表达载体pET16bPTDSH2. 将质粒pET16bPTDSH2转化感受态细胞BL21(DE3)，少量提取质粒DNA，用Xho I和BamH I进行双酶切电泳鉴定及阳性菌株的测序.

　　1.2.3目的蛋白的诱导表达将酶切鉴定正确的阳性克隆随机挑选4个接种在含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养液中，37℃振摇18 h后，按1∶100转接，37℃摇菌3 h，加入IPTG至终浓度为1.0 mmoL/L，37℃继续培养4 h. 将空载体及经过诱导的与未经诱导的PET16bPTDSH2分别制样：取1.0 mL细菌培养物，12 000 g离心1 min收集菌体，加入2×样品缓冲液剧烈振荡混匀，100℃煮沸10 min；12 000 g离心10 min；取上清进行120 g/L SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色；凝胶薄层扫描分析诱导蛋白含量.

　　1.2.4表达蛋白的可溶性分析大量诱导菌液, 离心收菌, 在冰浴条件下超声裂菌, 4℃离心, 分别收集上清液和沉淀, 将沉淀用8 mol/L的尿素重悬, 4℃下静置溶解; 将溶解的沉淀和上清液分别取样进行SDSPAGE电泳, 进行目的蛋白的表达形式分析.

　　1.2.5蛋白纯化和Western blot分析在证实目的蛋白以包涵体形式表达后, 用NiNTA resin柱亲和层析所溶解的沉淀(包涵体), 透析复性后冻干保存. 对纯化后的蛋白取样, 进行SDSPAGE电泳, 将样品蛋白电转移到NC膜上, 用抗His标签抗体封闭, 采用发光蛋白免疫印记法进行Western blot显示分析.

　　2结果

　　2.1人组织SH2基因的扩增PCR扩增SH2基因，扩增产物经琼脂糖电泳后出现一条约300 bp的DNA条带（图1），与预期结果相符，将PCR产物克隆入载体pMD18T中, 得到载体pMD18tSH2，送序列测定分析，测定结果与GenBank上登录的人类SH2的cDNA序列比对后显示此克隆的碱基序列正确.

　　图1SH2基因的PCR扩增结果　略

　　2.2重组质粒的构建和鉴定酶切pMD18TSH2和pET16bPTDCre载体,将目的片段亚克隆入PTD的下游, 获得重组融合表达载体pET16bPTDSH2（图2），以pET16bPTDSH2转化感受态细胞BL21, 增菌后提取质粒, 用Xho I和BamH I双酶切电泳鉴定，DNA序列分析表明所构建的质粒与设计相同，符合预期结果.

　　图2重组表达质粒pET16bPTDSH2的酶切鉴定　略

　　2.3融合基因PTDSH2在大肠杆菌中表达用空载体PET16b和重组载体pET16bPTDSH2分别转化感受态大肠杆菌, IPTG诱导后，分别取菌，处理后进行120 g/L SDSPAGE电泳（图3）.  结果表明, 经诱导的pET16bPTDSH2转化菌株在约Mr 15×103处出现一条新生蛋白条带，与预期结果相符合；而空载体pET16b转化的菌株及未诱导的细菌则无相应的蛋白条带出现，说明插入的融合基因PTDSH2已经成功地在大肠杆菌中表达. 灰度扫描分析, 表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的16%. 进行SDSPAGE分析, 蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在, 细菌的裂解上清中(可溶性表达部分)无目的蛋白存在（图4）.

　　图3融合蛋白的诱导表达　略

　　图4融合蛋白PTDSH2的可溶性分析　略

　　2.4融合蛋白的纯化和Western blot鉴定将包涵体溶解后, 对目的蛋白进行纯化, SDSPAGE电泳分析显示纯化的融合蛋白在Mr为15×103处呈单一条带（图5）. 取冻干后目的蛋白和已通过SDSPAGE分析证实含有目的蛋白的洗脱液为样品, 进行Western blot鉴定（图6）. 结果显示目的蛋白与抗His标签抗体有良好的反应性.

　　3讨论

　　SH2结构域是最广泛存在的能识别并结合含磷酸化酪氨酸的短序列，其在结构上高度保守；在细胞内，SH2结构域和磷酸酪氨酸肽段的特异性结合参与介导可逆性的蛋白重定位，此行为对PTK信号的有效增殖起着至关重要的作用［4］. 含cSrc同源序列SH2的酪氨酸磷酸酶是肝细胞生长因子受体Cmet下游重要的接头蛋白，现有的研究表明： SH2通过激

　　图5纯化蛋白的SDSPAGE分析　略

　　图6PTDSH2融合蛋白Western blot鉴定　略

　　活Erk, MAPK, p38, Jun等多条细胞信息通路，使其下游目标蛋白质分子中的酪氨酸脱磷酸化，引发瀑布式级联反应，在介导上皮细胞生长、发育、分化、凋亡、修复等多种生理过程及肿瘤细胞恶性转化等病理过程中起一定作用［5-6］. 因此，SH2所介导的蛋白之间的相互作用就成为了非常具有吸引力的性靶位点［7］. 抑制SH2结构域功能的方法主要有：通过融合蛋白的方式将体外合成的SH2结构域导入细胞内竞争结合底物分子，目前人工合成表达的Grb2, SHC, PLCg和vSrc的SH2结构域在体外均表现出结合目标肽段的活性［8］. PTD具有独特的跨膜运转方式［9］. Schwarze等［10］将PTD与Mr为(15～200)×103的蛋白进行融合后, 可以介导这些蛋白从细胞外到细胞内的直接跨膜转运, 说明PTD具有广谱的蛋白转导作用, 而且有转导速度快、效率高的特点. 本研究中我们成功构建了含有PTDSH2融合基因的质粒, 并使其在大肠杆菌中有效表达. 在SH2的N 端融合一PTD结构域，能使含SH2的Src蛋白快速有效地进入细胞内，使其竞争性结合底物分子而阻断信号转导过程，从而达到抑制SH2结构域功能的目的，安全性和针对性更好.

　　【】

　　［1］ Srinivasan M, Trivadi SG. Tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy［J］. Clini Biochem，2004, 37(3): 618-635．

　　［2］  Lundberg M, Wikstrom S, Johansson M. Cell surface adherence and endocytosis of protein transduction domains［J］. Mol Ther, 2003, 8(1)：143-150.

　　［3］　梁英民，蒋姗姗，韩骅. 蛋白转导结构域BCR/ABL融合基因的构建和表达［J］．中华血液学杂志, 2002, 23(1): 5-8．

　　［4］  Pawson T. Protein modules and signalling networks［J］. Nature, 1995, 373(6515): 573-580.

　　［5］  Selbach M，Moese S，Hurwitz R，et al. The Helicobacter pylori CagA  protein induces cortactin  dephosphorylation and actin rearrangement by CSrc inactivation［J］. EMBO， 2003, 22(3)：515-528.

　　［6］  Kim HY，Park EJ，Joe EH，et al. Curcumin suppresses Janus kinaseSTAT inflammatory signaling thmugh activation of Src homology 2 domaincontaining tyrosine phosphatase 2 in brain micmglia［J］. Immunology，2003, 171(11)：6072-6079．

　　［7］ Brugge JS. New intracellular targets for therapeutic drug design ［J］. Science, 1993, 260(5110): 918-919．

　　［8］  Hart CP, Martin JE, Reed MA. Potent inhibitory ligands of the GRB2 SH2 domain from recombinant peptide libraries cell ［J］. Cell Signal，1999，11(6)：453-464．

　　［9］  Vives E, Brodin P, Lebleu B. A truncated HIV1 TAT protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus［J］. Biol Chem, 1997, 272(25): 16010-16017.

　　［10］  Schwarze SR, Ho A, VoceroAkbani A, et al. In vivo protein transduction: Delivery of a biologically active protein into the mouse［J］．Science,1999, 285(5433): 1569-1572.