糖皮质激素在实验性变态反应性脑脊髓炎中对调节性T细胞的作用

【关键词】  糖皮质激素;,脑脊髓炎,自身免疫性,实验性;,T细胞;,FOXP3;,IL

　　Effect of glucocorticoid on CD4+CD25+ regulatory T cells in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis

　　【Abstract】 AIM: To investigate the modification by glucocorticoid on CD4+CD25+ regulatory T cells in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). METHODS: Glucocorticoid or placebo (control group) was injected into Balb/c mice that had been immunized with bovine myelin basic protein (MBP) extracted from the fresh spinal cord of OX. CD4+CD25+ regulatory T cell specific FOXP3 and blood IL10 were evaluated with flow cytometry and ELISA, respectively. RESULTS: Compared with the control group, less EAE symptoms were found in the glucocorticoidinjected group, and the levels of FOXP3 and blood IL10 were statistically different from those in the control group. CONCLUSION: Glucocorticoid can relieve the symptoms of EAE by increasing regulatory T cells and their activities, which offers a potential theoretic basis for its clinical application.

　　【Keywords】 glucocorticoid; encephalomyelitis, experimental autoimmune; T cells; FOXP3; IL10

　　【摘要】 目的：研究糖皮质激素在实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）中对调节性T细胞的调变作用. 方法：采用从新鲜牛脊髓中提取的髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫诱导Balb／c小鼠成功诱发EAE后，分组注射糖皮质激素或者安慰剂，在采用指标评估基础上，分别采用流式细胞术和ELISA方法检测CD4+CD25+调节性T细胞特异性FOXP3和血中IL10的表达水平. 结果：与对照组相比，糖皮质激素注射组小鼠发病程度轻，调节性T细胞特异性FOXP3和血中IL10的表达水平均有明显差异. 结论：糖皮质激素可能通过增加调节性T细胞的数量及活性，减轻EAE的症状，为临床治疗多发性硬化(MS)提供理论基础.

　　【关键词】 糖皮质激素; 脑脊髓炎,自身免疫性,实验性; T细胞; FOXP3; IL10

　　0引言

　　多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是由T细胞介导的、以中枢神经系统(CNS)白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病［1］. 糖皮质激素可通过多种途径调节免疫功能，是目前治疗MS 急性复发期的首选药物［2］. 在动物模型中，实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是一种由Th细胞介导的局限于中枢神经系统的迟发性超敏反应型自身免疫性疾病，被认为是人类MS公认的理想动物模型［3］. 本实验我们用从牛脊髓中提取出的髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)，同时注射百日咳杆菌菌液，诱发Balb／c小鼠产生EAE后，辅以糖皮质激素治疗，检测CD4+CD25+调节性T细胞特异性FOXP3和血中IL10的表达水平.

　　1材料和方法

　　1．1材料Balb／c雌性小鼠30只，6～8 wk龄，体质量17～20 g, 购自第四军医大学实验动物中心. 百日咳杆菌菌液购自成都生物制品研究所. 福氏完全佐剂（FCA）及其他未声明试剂皆购自Sigma公司，氢化可的松(hydroeortisone，HC)浓度为5 g/L，由天津金耀氨基酸有限公司提供. 检测鼠调节性T细胞的Mouse Treg FlowTM试剂盒购自Biolegend公司，IL10 ELISA检测试剂盒购自R&D System公司.

　　1.2方法

　　1.2.1MBP的提取及定量MBP的提取参照［4］：将获得的新鲜牛脊髓去除杂质洗净后, 将200 mL预冷的氯仿甲醇(2∶1)混和液与100 g牛脊髓用高速组织匀浆机制成组织匀浆. 将匀浆倒入烧杯中. 加入800 mL预冷的氯仿甲醇(2∶1)混和液，置于4℃冰箱磁力搅拌过夜. 将磁力搅拌后的匀浆进行真空抽滤后得到的滤渣重新加入1000 mL氯仿甲醇混和液，磁力搅拌过夜. 同法操作6次. 取滤渣用300 mL消毒纯水溶解，调pH至3.0. 置于4℃冰箱中，磁力搅拌4 h， 12 000 r／min离心1 h. 将上清液装入透析袋，放入消毒纯水透析过夜. 将透析袋用PEG20000浓缩3.5 h，分装，置于-70℃备用. 取少量浓缩液适量稀释后，紫外分光光度计上测定A260和A280，出浓缩液中的蛋白质浓度. 蛋白质浓度(g/L)=(1.45  A280-0.74 A260)×稀释倍数.

　　1.2.2EAE的诱导及发病动物的评估按照每只小鼠注射MBP∶FCA (1∶1)混和液0.4 mL，百日咳杆菌菌液∶PBS混合液(1∶50) 0.2 mL. 免疫时间：第1, 7日共免疫2次. 对照组的小鼠不注射抗原物质. 根据Kono等［5］的分级方法将小鼠的症状分为6级，具体为：0级（没有任何临床症状）；1级（动物尾部无力）；2级（动物尾部无力+前肢或后肢中等无力）；3级（前肢或后肢严重无力，人为翻身后不能恢复）；4级（肢体麻痹，人为翻身后不能恢复）；5级（濒死状态）.

　　1.2.3Balb/c小鼠EAE的糖皮质激素注射及外周血采集将Balb/c小鼠分为EAE诱导组、 EAE诱导同时肌肉注射生理盐水组和EAE诱导同时肌肉注射HC组，每组10只. EAE诱导同时肌肉注射HC组按照每只小鼠每日注射0.1 mL HC连续7 d或者到病情缓解. 7 d后每组各取5只小鼠心脏血液，抗凝存放. 其余5只进行发病评估.

　　1.2.4鼠外周血IL10及调节性T细胞检测将抗凝血稍静置，取上层血浆, 按照ELISA检测试剂盒说明书检测外周血IL10含量，余下血细胞用生理盐水混匀后，以小鼠调节性T细胞检测试剂盒Mouse Treg FlowTM测定调节性T细胞水平.
统计学处理: 实验所得数据用x±s表示,采用SPSS 10.0软件进行方差分析及LSDt检验,以P<0.05表示具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1小鼠指征评估与文献［4］描述类似，Blab/c小鼠在MBP等免疫条件下，最早第3日出现尾部无力、后肢稍外展的临床症状；第10~15日，症状达到高峰，出现质量减轻、行动非常缓慢、推之不动、弓背、尾部无力、后肢无力、明显外展、瘫痪等症状，最高临床分级达4级；第21日开始，症状缓解，第30日基本恢复正常. 但是在糖皮质激素治疗组，最早第10日开始时，才出现轻微的尾部无力、后肢稍外展的1到2级临床症状，第13~15日，症状达到高峰，出现质量减轻等症状，最高临床分级达到3级，病情较快缓解，到第19日基本恢复正常.

　　2.2小鼠调节性T细胞的检测在糖皮质激素组，CD4+CD25+和FOXP3+的调节性T细胞水平明显高于对照组［(15.8 ±3.2)% vs (2.4±1.6)%, P<0.05, n=5］和未治疗组［ (15.8 ±3.2)% vs (2.9±1.5)%, P<0.05, n=5］, 对照组和未治疗组间没有明显差别［(2.4±1.6)% vs (2.9±1.5), P>0.05, n=5］ (图1).

　　图1糖皮质治疗组调节性T细胞的分布　略

　　2.3小鼠外周血IL10水平的检测在糖皮质激素治疗组，IL10水平高于对照组［(80.5±8.6) ng/L vs (18.6±5.6) ng/L, P<0.05, n=5］和未治疗组［(80.5±8.6) ng/L vs (20.4±6.3) ng/L, P<0.05, n=5］, 对照组和未治疗组间没有明显差别［(18.6±5.6) ng/L vs (20.4±6.3) ng/L, P>0.05, n=5］.

　　3讨论

　　MS是T细胞介导的CNS脱髓鞘疾病，已致敏的T淋巴细胞通过血脑屏障进入脑内,在抗原呈递细胞作用下再次活化［6］. 以往发现，MS发病时,小胶质细胞作为CNS内最重要的抗原呈递细胞,对激活T细胞具重要作用［7］. 对于针对MS或者EAE糖皮质激素治疗的T淋巴细胞的研究中，往往着重于效应细胞，如CD4+ Th1/Th2细胞，或者CD8+的杀伤性T细胞，但是对于这几年的研究热点CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在糖皮质激素治疗下的调变，迄今未见报道.
　　
　　李茂全等［8］发现，在体外利用小胶质细胞系N9模型模拟EAE糖皮质激素治疗后，N9表面的抗原递呈分子MHC II和共刺激分子OX40L表达都显著下调. T细胞活化的双信号学说指出, 抗原呈递细胞将抗原处理成肽段与MHC 结合形成复合物提供T细胞活化所需的第一信号,而抗原呈递细胞与T细胞表面的共刺激分子相互作用提供第二信号［9］. OX40及其配体OX40L是近年发现的一对共刺激分子, 研究证实OX40/OX40L的作用为抗原呈递细胞维持活化后T 淋巴细胞功能所必需［10］. 与此同时，Ito等［11］发现OX40L分子能够从诱发阶段到效应阶段以及记忆性调节性T细胞的功能丧失. 所以我们考虑是否在EAE模型中，糖皮质激素一方面通过削弱小胶质细胞的APC功能，减低特异性T细胞杀伤效应；另一方面减弱OX40L的表达，从而减弱对局部调节性T细胞的“失能”效应. 我们的实验结果显示，糖皮质激素作用后，小鼠的EAE无论从发病的时间还是周期都明显改善，调节性T细胞的数量与单纯MBP免疫组和对照治疗组比较都有明显增加. 对应地，反映调节性T细胞功能的IL10分泌水平也明显增加. IL10也是抑制CD4+和CD8+ T细胞的重要细胞因子［12］.
　　
　　糖皮质激素对整个免疫过程的调节是多角度和多层次的［13］，我们的实验结论在一定基础上解释了临床上激素治疗对MS的缓解的原因. 由于小鼠的EAE模型和人类的MS有一定差距，基于临床患者中调节性T细胞的研究需要进一步进行.

　　【文献】

　　［1］ Hafler DA, Slavik JM, Anderson DE, et al. Multiple sclerosis［J］. Immunol Rev, 2005, 204:208-231.

　　［2］ Rizvi SA, Bashir K. Other therapy options and future strategies for treating patients with multiple lerosis［J］. Neurology, 2004, 63(12 Suppl 6): S47-S54.

　　［3］ Skundric DS. Experimental models of relapsingremitting multiple sclerosis: current concepts and perspective［J］. Curr Neurovasc Res, 2005, 2(4):349-362.

　　［4］ 贾怡，陈文捷，李虹，等. 牛MBP诱导BALB/c和C57BL/6小鼠实验性变态性脑脊髓炎样反应的研究［J］.免疫学, 2005, 25(3):187-190.

　　［5］ Kono DH，Urban JL，Horvath SJ，et al. Two minor determinants of myelin basic protein induce EAE in SJL/J mice［J］. J Exp Med, 1988, 168: 213-227.

　　［6］ Kanwar JR. Antiinflammatory immunotherapy for multiple sclerosis/experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) disease［J］. Curr Med Chem, 2005, 12(25):2947-2962.

　　［7］ Jack C, Ruffini F, BarOr A, et al. Microglia and multiple sclerosis［J］. J Neurosci Res, 2005, 81(3):363-373.

　　［8］ 李茂全, 王艳艳, 余晓东, 等. 糖皮质激素对活化后小胶质细胞株N9 中MHCII和OX40L表达的影响［J］.神经免疫学和神经病学杂志, 2006, 13(2): 69-72.

　　［9］ Peggs KS, Allison JP. Costimulatory pathways in lymphocyte regulation: the immunoglobulin superfamily［J］. Br J Haematol, 2005, 130(6):809-824.

　　［10］ Bertram EM, Dawicki W, Watts TH. Role of T cell costimulation in antiviral immunity［J］. Semin Immunol, 2004, 16(3):185-196.

　　［11］ Ito T, Wang YH, Duramad O, et al. OX40 ligand shuts down IL10producing regulatory T cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(35):13138-13143.

　　［12］ Xystrakis E, Boswell SE, Hawrylowicz CM.  T regulatory cells and the control of allergic disease［J］. Expert Opin Biol Ther, 2006, 6(2):121-133.

　　［13］ Herold MJ, McPherson KG, Reichardt HM. Glucocorticoids in T cell apoptosis and function［J］. Cell Mol Life Sci, 2006, 63(1): 60-72.