辛伐他汀对大鼠股骨骨折愈合的影响

                                   作者：梁春雨，张柳，赵文国，程爱国，王丽娜

【关键词】  辛伐

　　【关键词】 大鼠；骨密度；骨组织形态计量学；骨折愈合；他汀类药物

　　0引言

　　他汀类药物是目前临床用于降低胆固醇、预防心血管疾病的常用药物，其作用机制是抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，从而降低肝脏胆固醇的合成. Mundy等［1］的研究第一次表明，他汀类药物具有激活成骨细胞、促进骨合成代谢作用，这一发现为临床骨质疏松和骨折愈合提供了新的思路，成为目前对于研究骨代谢新药的一个热点问题. 为了进一步探讨该药物的成骨作用及其机制，我们通过建立大鼠骨折模型［2］的方法，进行了该药物对大鼠骨折愈合影响的初步实验研究.

　　1材料和方法

　　1.1动物模型制备与分组健康12周龄雌性SD大鼠20只，体质量(238±22) g. 以10 g/L戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠仰卧于手术台上，常规去毛、备皮、碘伏消毒，于右大腿中段外侧取纵形皮肤切口，长约2 cm，沿股外侧肌间隙钝性分离进入达股骨干，固定股骨，在骨干中1/3段用线锯锯断成横行骨折，此过程中注意保护坐骨神经和肌肉组织，然后，以直径约1.5 mm的克氏针逆行穿入骨折近端且从后侧股骨大粗隆穿出，复位骨折后再将其顺行穿入骨折远段髓腔，生理盐水冲洗，逐层关闭伤口. 然后，将动物随机分成两组（每组10只）：给药组（Fracture+Simvastatin）以5 mg/kg隔日灌胃给辛伐他汀药物一次；对照组（Fracture+Vehicle）以同样方法给与等量的生理盐水.
所有的受试大鼠在术后6 wk处死，并且处死前第10日和第4日分别皮下注射盐酸四环素和钙黄绿素行双荧光标记，处死后的大鼠取右侧股骨标本.

　　1.2观察指标

　　1.2.1CR摄片将大鼠完整右侧股骨干骨折标本经机X线摄相仪（CR）摄片（距离：90 cm、电压：40 KV、电流：3.2 mA・s），观察大鼠股骨骨折骨痂的连续性和测量骨痂最大直径.

　　1.2.2密度测定应用NorlandXR36双能X线骨密度测量仪（DEXA，美国），采用小物体扫描模式，准确度0.01%，扫描速度60 mm/s,分辨率（resolution） 1.0 mm×1.0 mm，扫描宽度5.0 cm的参数值，进行右侧股骨中1／3段（骨痂）骨密度的测量. 测量时，将固定骨折部位的克氏针拔除，其范围包含了以每个骨折部位为中心的无克氏针矩形区域，即：感性趣区.

　　为了评价精确度，随机选取一例，在位置不变的情况下，连续测量BMD各5次，精确度用变异系数CV表示（CV＝5%）.

　　1.2.3形态学染色将骨折骨痂标本，置入40 g/L多聚甲醛和0.6 mol/L戊二醛混合缓冲固定液中（pH=7.2～7.4），在4℃条件下固定24～48 h，再经0.3 mol/L EDTA2Na缓冲液（pH=7.4，4℃）脱钙，隔5～7 h更换脱钙液，经过3～5 wk后，经鉴定，脱钙完全. 然后,梯度乙醇脱水, 二甲苯透明，纵向石蜡包埋, 5 μm连续切片，HE染色，透明后中性树胶封片，Olympus显微镜下作普通光镜观察.

　　1.2.4骨组织形态计量学测定将骨痂标本固定后逐级脱水，浸入3∶7的甲基丙烯酸甲酯中24 h［真空负压651.88 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa),1次］，然后以半聚合甲基丙烯酸甲酯包埋制成实验标本. 采用Jung K硬组织切片机，每个标本连续切6张10 μm和4张5 μm厚的不脱钙骨切片，其中5 μm薄片采用甲苯胺蓝染色用于普通光学显微镜下观察和测量，10 μm厚片用于荧光显微镜下观察测量.

　　统计学处理： 实验数据建立EXCEL数据库，资料用SPSS 11.0来处理，采用成组t检验. 数据用x±s表示，以P＜0.05表示具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1CR摄片观察观察大鼠离体右侧股骨干CR片发现，对照组和给药组大鼠骨折端均有连续性骨痂包绕，骨折线模糊或消失，骨痂量没有明显的差别，未发现内固定克氏针松动现象，但是，给药组有3只股骨干的骨折骨痂塑形明显好于对照组；测量所得两组骨痂最大直径宽度，对照组：（4.35±0.48）mm，给药组：（4.43±0.39）mm，经统计学分析差异无显著性（P＞0.05）.
2.2骨密度测量骨痂骨密度测量结果(g/cm2)显示，对照组：0.1208±0.0101，给药组：0.1292±0.0075，经统计学分析差异有显著性（P＜0.05）.

　　2.3组织学观察给药组与对照组比较骨痂中均主要以骨性骨痂为主，软骨骨痂少见或基本消失，小梁骨成熟度较高，成骨细胞功能活跃，破骨细胞少见，不典型，骨小梁粗细均匀一致，间距无明显增宽，二者比较无明显的组织形态学差异.

　　2.4骨组织形态计量学测量对照组及给药组的BV/TV（%），Tb.Th（μm），Tb.N（#/mm），Tb.Sp（μm）分别是31±5，40±6；157±48，136±38；3.0±0.4，3.8±0.5；351±25，314±25. 其中，两组Tb.Th经统计学分析差异无显著性（P＞0.05），BV/TV，Tb.N，Tb.Sp经统计学分析差异有显著性（P＜0.05）.

　　3讨论

　　他汀类药物是临床上广泛应用的一种降血脂药物，然而，Mundy等［1］通过动物实验，在对3万多种天然或人工化合物的筛选中，意外发现它还是所选药物中唯一具有激活成骨细胞、促进骨合成代谢作用的药物. 该实验将他汀类药物加入小鼠（2T3）和人（MG63）成骨细胞培养液中，经印迹杂交方法分析显示，BMP2mRNA的表达水平明显提高，而且BMP2的表达成特异性，但它并没有增加BMP4、IL6、甲状腺素及相关多肽的表达. 在经2.5 μL辛伐他汀处理的人MG63成骨细胞培养液中，BMP2的产量可增加2.7倍. 体外药物实验证明，辛伐他汀可刺激成骨细胞增加特异性荧光素酶的活性. 但是，这一作用可以被还原酶的下游代谢产物甲羟戊酸所阻断，尽管甲羟戊酸可能与细胞胆固醇合成通路无关，但仍提示他汀类药物的促骨形成作用与此酶受抑制有关. 此外，他汀类药物还可提高体外培养的新生小鼠颅盖骨细胞的数量与新骨生成量.

　　Sugiyama等［3］进行了更深入的研究，他们将一种包含了人类BMP2基因5’F启动子区的荧光素酶报告基因转染给人类骨肉瘤细胞，在加入辛伐他汀后发现，该药物具有促进骨肉瘤细胞BMP2基因表达的专一性. 而对于BMP4或猴病毒40启动子活性几乎没有影响，通过反转录PCR分析和碱性磷酸酶检测显示其能诱导BMP2 mRNA和蛋白表达的增加.

　　目前，对于他汀类药物的研究结果并不一致，Mundy等［1］的实验认为他汀类药物促进骨形成，抑制骨吸收；而Maritz等［4］认为不同的他汀类药物和剂量对骨的影响是不一样的，高剂量既增加骨形成，又增加骨吸收；低剂量降低骨形成，同时增加骨吸收；并且不能阻止因卵巢切除所引起的骨丢失；Bjarnason等［5］认为氟伐他汀在目前临床剂量下对骨再建参数没有影响，而其他他汀类药物则有待进一步研究.  在临床研究中，他汀类药物是否具有骨保护作用而降低骨折危险性，也存在截然相反的观点［6-9］.

　　本组实验中给药组与对照组比较发现，给药组离体股骨骨痂塑形较好，虽然组织形态学未见明显差异，但是，BMD值显著增加，骨组织形态计量学参数中，BV/TV，Tb.N值显著增加，Tb.Sp值显著减少，表明骨量增加. 由此可见，辛伐他汀具有明显的成骨作用，这种成骨作用表现为离体股骨骨痂骨密度和骨量的增加，反映在骨组织形态计量学静态参数指标中，主要是通过显著增加Tb.N（P＜0.05），而不是增加Tb.Th（P>0.05），这也间接说明，该药物对骨吸收的作用并不是显著抑制.

　　从各方面的研究来看，认为他汀类药物促进骨形成的作用机制主要是通过增加BMP2启动因子的数量，从而促进成骨细胞合成BMP2，而BMP2是公认的成骨细胞转化促进因子［10］. 关于他汀类药物直接的对骨折愈合影响的动物实验研究目前报道甚少，本实验我们尝试从骨组织形态计量学方面来探讨其对骨折愈合的影响，研究结果初步证实，辛伐他汀可以显著增加骨折骨痂的骨量和骨密度，具有促进骨折愈合的作用；但是，由于骨组织形态计量学动态参数指标受骨痂成熟度的影响明显，给实际测量带来不确定性，因此，本实验未采用该指标的测量和统计学检验，对于该指标更确切的观察，应在骨痂改造塑形基本或全部完成后进行. 这也提示:用骨组织形态计量学指标进行骨折愈合研究时，应在骨折愈合的后期.

　　【】

　　［1］ Mundy G, Garrett R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins［J］. Science,1999,286(5446): 1946-1949.

　　［2］ Murakami S,Noda M. Expression of indian hedgehog during fracture healing in adult rat femora［J］. Calcif Tissue Int,2000,66(4):272-276.

　　［3］ Sugiyama M, Kodama T, Konishi K, et al. Compactin and simvastatin, but not pravastatin, induce bone morphogenetic protein2 in human osteosarcoma cells［J］. Biochem Biophys Res Commun,2000,271（3）:688-692.

　　［4］ Maritz FJ, Conradie MM, Hulley PA, et al. Effect of statins on bone mineral density and bone histomorphometry in rodents［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21（10）:1636-1641.

　　［5］ Bjarnason NH, Riis BJ, Christiansen C. The effect of fluvastatin on parameters of bone remodeling［J］. Osteoporos Int,2001,12(5):380-384.

　　［6］ Chan KA, Andrade SE, Boles M, et al. Inhibitors of hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase and risk of fracture among older women［J］. Lancet,2000,355（9222）:2185-2188.

　　［7］ Meier CR, Schlienger RG, Kraenzlin ME, et al. HMGCoA reductase inhibitors and the risk of fractures［J］. JAMA,2000,283(24):3205-3210.

　　［8］ Reid IR, Hague W, Emberson J, et al.  Effect of pravastatin on frequency of fracture in the LIPID study: Secondary analysis of a randomised controlled trial. Longterm intervention with pravastatin in ischaemic disease［J］. Lancet,2001,357(9255):509-512.

　　［9］ Whitfield JF. Statins: New drugs for treating osteoporosis［J］？Expert Opin Investig Drugs,2001,10（3）:409-415.

　　［10］ 张胜利，王金平. 骨质疏松骨折愈合过程中TGFβ mRNA的基因表达［J］. 第四军医大学学报，2001，22（6）：497-500.