增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

                                                               作者：高峰，田玉科，杨辉，安珂，张传汉 

【关键词】  增强

　　Gene expression of enhanced green fluorescent protein in immortalized neural progenitor cells strain of rat

　　【Abstract】 AIM: To study the transfection efficiency and the expression of enhanced green fluorescent protein（eGFP） in immortalized neural progenitor cells（INPCs） mediated by recombinant adenoassociated virus（rAAV）. METHODS:  The viral vector of rAAV containing eGFP was transfected into INPC. The expression of green fluorescent protein was observed since 24 h after transfection and the transfection efficiency was measured. Antinestin antibodies and simian virus 40 large T antigen gene (SV40Tag) antibodies were used to identify the transfected cells. The specific molecular markers of neurons and astrocytes were detected using immunocytochemistry method to investigate the capability of differentiation of the transfected cells after being induced by 50 mL/L fetal bovine serum. RESULTS:  EGFP expression was detected as early as 24 h after transfection. The number of eGFP positive cells reached about 90% after 72  h. After being cultured for 8 weeks, 70%-75% INPCs were still eGFP positive. The transfected cells were confirmed as nestin positive and SV40Tag positive cells with immunocytochemistry and could be differentiated into neurons and astrocytes by the induction of fetal bovine serum. CONCLUSION:  The viral vector of rAAV containing eGFP can be highly transfected into INPCs and the transfected cells show a stable and longterm eGFP expression in vitro. EGFP can be a valuable tracking tool for the study of neural progenitor cell transplantation.

　　【Keywords】 neural progenitor cell; recombinant adenoassociated virus; green fluorescent protein; gene transfection

　　【摘要】 目的：研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况. 方法：携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞，持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况，并转染效率. 应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定，50 mL/L胎牛血清诱导细胞分化后，应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力. 结果：荧光显微镜观察显示转染后24 h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达，转染后72 h，大部分细胞表达绿色荧光蛋白，转染效率可达90%. 经传代培养8 wk后，表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70%～75%. 免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性，50 mL/L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞. 结论：携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞，并可在细胞中长期稳定地表达，绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植.

　　【关键词】 神经前体细胞；重组腺相关病毒；绿色荧光蛋白；基因转染

　　0引言

　　神经前体细胞（neural progenitor cell, NPC）是一类可以分裂增殖、自我更新并具有多分化潜能的细胞［1］. 它可以作为神经细胞的种子细胞，在细胞移植和细胞介导的基因治疗中具有潜在的临床应用价值［2-3］. 永生化神经前体细胞（immortalized neural progenitor cell, INPC）在体外培养中能够自我更新和无限扩增，可以为细胞移植提供大量表型、基因型稳定的NPC［4］. 我们将重组腺相关病毒（recombinant adenoassociated viral, rAAV）载体介导的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）基因转染入大鼠INPC，并观察GFP的表达情况，以探讨eGFP作为细胞示踪标记的可行性，为今后INPC应用于体内移植奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　基础培养基Neurobasal（GIBCO公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）（PeproTech公司）；B27, 0.1 g/L多聚鸟氨酸和明胶（SIGMA公司）；小鼠抗大鼠巢蛋白（nestin）抗体、抗猿肾病毒40大T抗原（simian virus 40 large T antigen gene, SV40Tag）抗体、微管相关蛋白（microtubuleassociated protein2, MAP2）抗体和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）抗体（NeoMarkers公司）；DAB免疫组化试剂盒（北京中山公司）.

　　1.2方法

　　①细胞培养： SV40Tag转染原代大鼠NPC后建立的INPC株由本研究室构建［5］并保存. INPC应用含20 mL/L B27，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF的无血清Neurobasal培养基，在预先采用10 mg/L多聚鸟氨酸和2 g/L明胶包被的培养瓶中进行贴壁培养. 每5~6 d传代1次，待细胞长至80%汇合，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，以单个细胞形式贴壁继续培养. ②基因转染：待INPC长至80%汇合，按105 v.g./个细胞的浓度加入rAAV/eGFP病毒颗粒（本研究室构建）进行转染. 转染6 h后细胞换液，进行常规传代培养8 wk. 转染后24 h开始荧光显微镜下观察GFP表达情况，并计算转染效率. ③转rAAV/eGFP INPC及其诱导分化的鉴定： 转rAAV/eGFP INPC采用无水甲醇固定，应用免疫细胞化学法进行nestin，SV40鉴定. 细胞培养基中加入50 mL/L胎牛血清诱导INPC分化6 d，固定后应用神经元和星形胶质细胞标志物MAP2和GFAP相应抗体检测INPC分化情况.

　　2结果

　　贴壁培养的INPC的形态以椭圆形或三角形为主，有两到三个短的突起，胞核较大，呈圆形，胞质较少. 可见到细胞的分裂相和增殖细胞，并可观察到细胞迁移现象. 转染rAAV/eGFP的INPC仍呈单层贴壁生长，细胞形态无变化. 荧光显微镜下观察可见INPC转染rAAV/eGFP 24 h后即有少量细胞表达GFP（图1）；48 h阳性细胞明显增多，荧光强度增强；至72 h大部分细胞表达GFP，转染效率可高达90％，多为明亮的绿色荧光，少数表达较高，呈黄绿色（图2）. 经传代培养8 wk后，表达GFP的阳性细胞仍可高达70%～75%，细胞生长特性未见明显改变.

　　免疫细胞化学检测可见细胞呈nestin染色阳性，细胞染色部位在胞质，而胞核不着色呈空泡状（图3），同时细胞SV40染色为阳性（图4）. 在培养基中加入血清后，第3日可观察到大量不同形态的新生神经细胞，细胞主要呈现2种形态，即具有一个或两个长突起胞体呈圆形或椭圆形的神经元样细胞和具有多个粗长突起的星形胶质细胞样细胞. 荧光显微镜下观察到分化后的细胞仍表达GFP. 免疫细胞化学检测大多数细胞呈GFAP阳性（图5），少数细胞呈MAP2（图6），而nestin表达均为阴性.

　　3讨论

　　近年来的研究使人们相信，将体外培养的NPC移植入受损的中枢神经系统，有可能实现正常神经功能的重建，NPC移植有望成为神经系统疾病的有效手段［2］. 而当NPC作为细胞载体携带目的基因移植入中枢神经系统后，亦可整合入移植区，与周围神经细胞建立突触联系，表达目的蛋白［6］. NPC移植入体内后，如何能够深入了解NPC在特定的周围微环境诱导下的存活、分裂以至最终分化成为形态和功能与周围宿主细胞相似的细胞类型的过程，仍是目前NPC移植研究的重点之一.

　　1992年Prasher等［7］成功克隆出水母的GFP基因cDNA，GFP在一定波长的紫外线激发后即可发出明亮的绿色荧光. eGFP是一种优化的突变型GFP，产生的荧光比野生型GFP强35倍，已被作为一种报告分子用于细胞基因表达和蛋白定位的检测［8］, 而eGFP因其结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点［8］，更适用于作为一种细胞示踪标记，应用于细胞移植研究. 本研究我们利用rAAV载体将eGFP转染入大鼠INPC，以期了解eGFP作为NPC示踪标记的可行性. 结果显示INPC转染rAAV/eGFP后早期即有GFP的表达，而在72 h后90％的NPC中可观察到明亮的绿色荧光. 而在经持续传代培养8 wk后，仍有70%～75%的细胞表达GFP. 这表明腺相关病毒介导的基因转染可在NPC中达到较高的转染效率，由于腺相关病毒可使外源基因定点的整合在细胞染色体上，因此在经过长期传代培养后，NPC仍可持续稳定地表达外源性基因，且本结果已证实腺相关病毒介导的外源性基因定点整合对细胞本身的生长特性无明显影响. 当将eGFP导入INPC后，NPC特异性标志nestin以及SV40的表达仍为阳性，而在培养基中加入血清诱导其分化后，转rAAV/eGFP INPC可分化为神经元和星形胶质细胞，分化后的细胞仍表达GFP，因此可见转rAAV/eGFP INPC仍保持了NPC的基本特性，eGFP对SV40Tag的表达无影响，且血清诱导NPC分化后INPC仍可稳定的表达eGFP. 以上结果均表明eGFP可在NPC中长期持续稳定的表达，并可作为细胞示踪标记以观察细胞的增殖、分化等特性.

　　本研究证实携带eGFP的rAVV可高效转染INPC，eGFP在NPC中可长期稳定表达，转rAAV/eGFP INPC保持了NPC的基本特性，eGFP可作为良好的细胞示踪剂应用于NPC的体内移植，这为今后研究NPC在体内的存活、增殖、分化过程奠定了基础.

　　【】

　　［1］ Galli R, Gritti A, Bonfanti L, et al. Neural stem cell: An overview［J］. Circ Res, 2003, 92(6): 596-608.

　　［2］ Kelly S, Bliss TM, Shah AK, et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex［J］. PNAS, 2004, 101(32): 11839-11844.

　　［3］ Conti L, Cataudella T, Cattaneo E. Neural stem cells: A pharmacological tool for brain diseases?［J］ Pharmacol Res, 2003, 47(4): 289-297.

　　［4］ Roy NS, Nakano T, Keyoung HM, et al. Telomerase immortalization of neuronally restricted progenitor cells derived from the human fetal spinal cord［J］. Nat Biotechnol， 2004, 22(3): 297-305.

　　［5］ 高峰，田玉科，杨辉，等. 猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建［J］. 中华麻醉学杂志, 2005,25(8):597-600.

　　［6］ Harrower T, Barker RA. Cell therapies for neurological disease-from bench to clinic to bench［J］. Expert Opin Biol Ther， 2005, 5(3): 289-291.

　　［7］ Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, et al. Primary structure of the aequorea victoria greenfluorescent protein［J］. Gene， 1992, 111(2): 229-233.

　　［8］ Heim R, Cubitt AB, Heim RA, et al. Improved green fluorescence［J］. Nature， 1995, 373(6516): 663-664.