胆石症患者胆囊黏膜免疫复合物及血清CIC和Ig的变化

                                                                                   作者：周玉宝 赵智凝 邵景元

【摘要】  　　目的: 研究免疫复合物（IC）在胆石症发生中的作用及意义. 方法: 胆石症患者101 (男39, 女62)例, 年龄(48.4±14.4)岁,手术切除胆囊组织切片IC免疫组化染色，术前和术后5 d测定循环免疫复合物（CIC）和Ig. 结石行IC免疫组化染色. 结果：与健康对照组比较, 胆结石患者术前血CIC增高（5.3±1.5 vs 1.2±0.8, P<0.01), IgG降低（8.7±2.0 vs 11.2±3.2, P<0.05),术后恢复正常；胆石中IC阳性率为82%（41/50），组织切片中IC阳性率90%（91/101）. 结论：胆石症患者血清中CIC和Ig有明显改变.

【关键词】  胆石症 免疫组化 免疫球蛋白 免疫复合物

      0引言

    胆石症是我国常见病［1］. 国内尸检报告胆石发生率为7%，随年龄增长发病率也增加. 近年来使用B型超声检查人群胆石发生率达10%左右. 在中年妇女胆石症的发病率高达15%. 且随着人民生活水平的提高其发生率还在不断上升. 研究表明，免疫复合物是胆色素结石形成的很重要因素之一［2］，我们对胆石症患者胆囊黏膜进行免疫复合物免疫组化检测及手术前后血清循环免疫复合物（CIC）和Ig含量检测以提示免疫复合物在胆石症发生发展中的作用及意义.

    1对象和方法

    1.1对象2005?11／2006?06我院外科因胆石症行胆囊切除手术患者101（男39，女62）例，年龄14~75（48.4±14.4）岁. 其中病理诊断胆囊炎伴胆石症98例，胆囊息肉伴结石1例,单纯胆囊息肉2例. 健康对照组：20(男8，女12)例来自门诊体检健康人群,年龄18~65(45.3±10.7)岁. 免疫球蛋白检测试剂购于温州伊利康生物技术有限公司. 葡萄球菌A蛋白辣根过氧化物酶由第四军医大学免疫教研室赠送. 底物液A邻苯二胺，B H2O2购于珠海亚利生物有限公司.

    1.2方法选取50名患者，采集其手术前及手术后5 d血清并于手术中采用无菌方法收集结石标本. 血浆CIC测定采用聚乙二醇(PEG)沉淀比浊法，Ig测定采用免疫透射比浊法. 将结石标本用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤后，压细，取适量放入10 mm×20 mm试管中，再加pH 7.4的PBS缓冲液离心洗2次，弃上清液，留沉渣，加葡萄球菌A蛋白辣根过氧化物酶0.2 mL，37℃水浴2 h，用pH 7.4的Tris2Tween20缓冲液离心洗涤3次，加底物A, B液混匀37℃水浴15 min，观察颜色的反应，反应体系呈深蓝色为阳性，否则为阴性. 采集全部101名患者胆囊组织，制作胆囊组织切片. 标本切片厚4 μm，石蜡切片常规脱蜡，置于pH 6.0的0.01 mmol/L枸橼酸钠溶液中5 min，3次，在20℃用含H2O2的甲醇溶液处理30 min. 每张切片滴加葡萄球菌A蛋白辣根过氧化物酶60 μL，稀释度为1∶50, 37℃孵育45 min，用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤3次，加底物A,B液混匀，37℃孵育15 min，观察结果. 在组织切片中胆囊基底膜呈深蓝着色为阳性，否则为阴性.

    统计学处理: 数据采用x±s表示, 用SPSS软件行统计分析，组内前后比较用配对t检验，组间比较用方差分析.

    2结果

    胆结石患者手术前后血中CIC和IgG有明显变化：与对照组比较，术前血CIC增高（P<0.01)；IgG降低（P<0.05)；而血中IgA和IgM无变化(表1). 术后恢复正常；50例结石中41例IC酶免疫组化染色阳性(图1). 在101例组织切片中91例胆囊黏膜基底膜IC阳性，10例为阴性(图2). 表1胆石症患者手术前后CIC, Ig的变化

    3讨论

    当人体遭受抗原入侵或者出现自身抗体, 就会引起免疫应答和形成IC, 但后者迅速即被吞噬细胞吞噬、消化和清除, 此为机体的正常免疫应答. 只有当形成的IC不能被及时地清除并于局部沉积时, 才有致病作用. 而IC沉积于组织时引起组织损害也是其最重要的生物活性［3］. 1963年首次测得人胆汁中有Ig以来， 胆石症患者免疫功能的改变在成石过程中的作用才逐渐引起人们的重视. 我们首次表明, 胆石症手术前后血清中IC含量有明显改变. 术前血中CIC高,术后CIC明显降低, 而IgG术后明显增高. 术前CIC较高的原因可能是［4-5］: ①结石部向血液里不断释放抗原与血液中的IgG形成CIC, 从而也使血液中IgG相应的降低; ②结石部不断向血液里释放IC使血液中CIC增高；③由于胆管梗阻, 肝功能受到一定的损害, 网状内皮系统功能受到抑制, 导致IC在血中的清除率降低. 术后CIC降低的原因可能是①结石摘除, 使释放到血液中的IC减少; ②结石摘除, 使形成CIC的抗原减少. 术后IgG增高的原因可能是: ①抗体的反跳,血液内抗体对B细胞的增殖分化功能有负反馈调节作用, 随CIC的减少, 体内B细胞迅速增殖分化, 以致大量新抗体产生; ②随CIC降低, 血液中封闭因子减少, 免疫耐受解除, 体液免疫增强. 我们证实大部分结石中存在IC, 阳性率为82%. IC，IgG与胆石症有密切的关系. 正常状况下，胆管处于“防御”和“损伤”的动态平衡，即成核和抗成核蛋白共存，而往往抗成核因素占主导地位［6］. 在胆道感染和梗阻的基础上，胆管水吸收障碍，失去了正常降低蛋白质浓度功能. 再加上Ig分泌细胞增多，激活补体，导致炎症反应，损害胆管黏膜；同时细菌作为抗原, 刺激机体局部产生IgG, IgG与细菌抗原结合形成IgG型IC, 沉积于胆道, 是结石形成的原因. IgG通过特异性膜受体结合多种细胞（如巨噬细胞、单核细胞等），巨噬细胞因受结合免疫复合物的激活而具有细胞毒性并释放溶菌酶，从而加重黏膜损伤，促进胆道结石形成. 这种机制与国内报道的动物试验结果比较相符. 我们发现９０％胆囊黏膜基底层有IC沉积，由此可见，IC虽不是致石的直接原因，但IC在胆囊黏膜的沉积通过活化补体，促进中性粒细胞浸润, 激活过程中产生大量生物活性物质, 使肝细胞和胆管上皮发生剧烈的炎症反应,加重胆管等组织的损伤. 由于在IC沉积处补体成份被活化, 被活化的补体在清除IC的同时也造成黏膜等组织损伤, 因此IC的存在是胆石病, 尤其是胆囊结石时胆囊黏膜破坏的一个重要的病理原因, IC在局部的不断形成和沉积也是胆石病迁延不愈、反复发作的原因之一. 因此, 清除胆道抗原对机体的刺激将成为预防胆结石形成的有效方法; 控制IC的沉积将是控制胆石发生的有效方法［7-8］.

【】
  ［1］ 韩天权，姜羽戈，张圣道. 胆固醇结石病的病因和机制研究进展［J］. 肝胆胰外科杂志， 2006, 18（5）：269-270.

［2］ 洪智贤，何小东. 胆囊成因研究进展［J］. 消化外科， 2006, 5（6）: 479-482.

［3］ Malcolm A. Susceptibility to cholesterol gallstone formation: Evidence that LITH genes also encode immune?related factors［J］. Biochim Biophys Acta, 2006, 1761(10):1133-1147.

［4］ Lyons MA, Wittenburg H. Cholesterol gallstone susceptibility loci: A mouse map, candidate gene evaluation, and guide to human LITH genes［J］. Gastroenterology, 2006, 131(6):1943-1970.

［5］ Maurer KJ, Ihrig MM, Rogers AB, et al. Identification of cholelithogenic enterohepatic Helicobacter species and their role in murine cholesterol gallstone formation［J］.Gastroenterology, 2005, 128(4): 1023-1033.

［6］ Portincasa P, Moschetta A, Palasciano G. Cholesterol gallstone disease［J］. Lancet, 2006, 368(15):230-239.

［7］ Portincasa P, Moschetta A, Petruzzelli M, et al. Gallstone disease: Symptoms and diagnosis of gallbladder stones［J］. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2006, 20(6) 1017-1029.

［8］ Silva MA, Wong T. Gallstones in chronic liver disease［J］. J Gastrointest Surg, 2005, 9(5):739-746.