hHGF基因肾脏电转染对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

                                                             作者：李宓 杜艺 陈家湄 彭莉 邹和群

【摘要】  　　目的: 使用肾脏直接基因电转染方法对大鼠肾脏进行hHGF基因转染，观察该基因转染对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用. 方法: 雄性SD大鼠20只，随机分为转染组和对照组，每组10只. 在热缺血前3 d将含有hHGF基因的质粒用电转染方法转入大鼠肾脏，3 d后建立大鼠肾热缺血模型，观察hHGF的药代动力学，并对缺血肾脏进行功能和组织学评价. 结果: hHGF基因电转染组肾组织及血浆hHGF基因表达水平高于对照组(P<0.01). 转染组血肌酐水平低于对照组(P<0.01),肾功能恢复快于对照组. 组织学评价显示，转染组肾小管细胞凋亡评分低于对照组(P<0.05). 转染组淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润均较对照组少. 结论: 肾脏hHGF基因电转染组hHGF药代动力学和效果均显示，该基因电转染对肾脏缺血再灌注损伤有保护作用.

【关键词】  肾脏 缺血再灌注损伤 人肝细胞生长因子 基因治疗

      0引言

    缺血再灌注损伤引起的急性肾衰与移植肾的慢性进行性损伤及远期移植肾失功有着密切的关系［1］. HGF是一种多肽的细胞因子，是肾脏的调理素，可促进组织重建，减轻组织纤维化和功能障碍［2］. 但该细胞因子注入体内后其活性极不稳定，不能发挥其器官保护功能，因此我们将通过肾脏直接电转染hHGF基因的方式，观察该基因对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用，从而为移植肾的缺血再灌注损伤寻找一种体外器官治疗的方法.

    1材料和方法

    1.1材料健康雄性SD大鼠20只，体质量250~300 g，购于北京大学试验动物中心. DNA结合SP1017（加拿大 Laval ）, 鼠抗鼠mAb（Oxford UK），ELISA  hHGF检测试剂盒（Quantikin ）, CD45RC(Oxford UK), 马抗羊IgG（美国Vector Laboratories）,DAB显色剂（Sigma?Aldrich ），PARP凋亡过氧化酶试剂盒（西班牙Labclinics Barcelona ）,分光光度计（Beckman）, BTXECM830电转染机(Harvard Apparatus ).

    1.2方法

    1.2.1分组随机分为2组，A组：热缺血45 min+非治疗组（n=10）；B组：热缺血45 min+肾脏电转染组(n=10).

    1.2.2引物设计用Primer分析软件设计1对引物，上游引物为5′?ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA?3′；下游引物为5′?ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTGTTTCG?3′；引物由大连宝生物工程有限公司合成. 以pRC/CMV?hHGF为模板进行扩增，全长为1340 bp. cDNA PCR反应体系：50 μL，引物0.8 μg，模板0.1 μg，常规量dNTPs，Mg2+及Taq酶，反应体系95℃ 1 min，40℃ 50 s，70℃ 2 min,循环5次，95℃ 1 min，60℃ 50 s，72℃ 2 min，循环25次，72℃延伸5 min. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用EcoRI和BamHI消化后与载体pBSks连接. 产物用CaCl2法转化E.coli JMI09，以碱裂解法提取质粒 ，质粒DNA结合SP1017，结合后的基因治疗效果较裸体DNA电转染的治疗效果为佳，将质粒DNA溶解于的TE缓冲液中（浓度为4 g/L），等量的质粒DNA和2 g/L SP10170混合制成2 g/L的DNA及0.1 g/L的SP1017混和液备用.

    1.2.3hHGF基因肾脏电转染手术暴露肾和肾蒂，在接近腹主动脉处用血管钳夹闭双肾动脉以防注入的液体流出，但肾动脉夹闭时间不能超过12 min以避免严重的缺血损伤，立即由双肾动脉注入400 μL含有hHGF质粒的混悬液及100 U胰岛素，用电极片夹起肾脏，并给以电脉冲，频率为1HZ，每次6个50 ms的电脉冲，电压为100 V［3］. 于电转染3 d之后，在37℃环境中，麻醉后切开腹腔，暴露左肾，夹闭肾A和肾V 45 min，然后打开. 常温下室内饲养1 wk，在第1,3,5,7日检测大鼠的体质量，由尾静脉采血检测血肌酐水平，在肾缺血第8日取出左肾进行组织学和分子生物学分析. 于缺血后1，3，5，7 d由鼠尾静脉采血放入EDTA管，900 g 30 min离心，取上清试管加盖后4℃冰箱保存，ELISA法检测hHGF.

    1.2.4组织学评价及组织hHGF基因表达在缺血后8 d取大鼠左肾制成组织石蜡包埋块，并将包埋块切片（3～4 μm），脱蜡后分别用苏木素?署红及PAS染色. 根据肾小管坏死和再生情况，从病角度将其分为0~3分. 0分：正常组织；1分：少于1/3的组织受损；2分：1/3~2/3的组织受损；3分：所有组织受损. 肾小管受损的评估标准为：细胞肿胀、凋亡，细胞支持消失，刷状缘破坏. 肾小管修复的标准：出现细胞核的有丝分裂. 肾组织hHGF基因表达检测采用免疫组化法，见［4］.

    1.2.5巨噬细胞及淋巴细胞的免疫组化1抗使用1∶100稀释的鼠抗鼠mAb，作用于巨噬细胞的ED?1， 1∶200稀释的鼠抗鼠mAb及1∶25稀释的羊抗人多克隆HGF抗体作用于T和B淋巴细胞蛋白CD45RC. 使用1∶200稀释的马抗鼠IgG作为二抗和1∶200稀释的马抗羊IgG，显色剂使用DAB显色［4］.

    1.2.6组织过氧化物氧化评价大鼠肾组织中性粒细胞浸润通过白细胞MPO方法进行评估. 将组织中加入pH 6.0 50 mol/L的kd缓冲液中（含5 g/L的溴化十六碳烷基三胺）快速液氮冷冻，然后30 s解冻，重复3次，60℃孵育2 h,离心后取上清检测MPO，MPO用偶氮蓝和5 mg/L的氢氧化物显色，用460 nm的分光光度计检测MPO浓度. 采用PARP凋亡过氧化酶试剂盒进行检测. 肾脏内ED?1, CD4SRC及凋亡细胞的阳性染色细胞在40倍显微镜下计数20个视野均数.

    统计学处理: 采用统计学软件SPSS 10.0进行统计学分析. 计量资料以x±s表示，组间比较采用成组t检验，组内比较采用配对的t检验.

    2结果

    2.1血浆及肾组织hHGF表达B组血浆hHGF水平在电转染后0 d为0，3 d开始增高为(55.8±5.3) ng/L，在第7日达到最高水平为(76.9±11.7) ng/L，10 d的HGF浓度与第7日比较无明显差异（76.4±2.1 ng/L, P>0.05），A组血浆中未检测到hHGF. A组未见hHGF表达（图1A）,B组所有肾组织均显示了hHGF免疫阳性染色（图1B）.

    2.2hHGF基因对缺血后肾功能恢复的影响治疗组的血清肌酐浓度均低于未治疗组. 由于大鼠肾脏抵抗热缺血的程度不同,因此在热缺血后的血肌酐值差别较大（表1）.

    2.3肾小管坏死与细胞凋亡的量化分析热缺血肾脏显示了严重的肾小管坏死. B组肾小管坏死组织评分明显低于A组（表1）. 通过观察凋亡细胞的免疫染色发现B组与A组之间有统计学差异（表1）. 本组发现A组肾小管上皮细胞凋亡情况差异较大，这可能是由于大鼠个体抗缺血能力的差异所致. 然而，在B组显示了较为统一的肾组织保护作用（图2），为了进一步证实上述结果，本组用PARPp85进行免疫染色并获得了相似的结果（图2）. 表1hHGF基因电转染后血清肌酐，肾小管坏死，肾组织炎细胞计数的变化

    2.4细胞增殖与再生hHGF基因治疗后2 wk内,A组组织学评分为1.063±0.749，B组为1.470±0.631 (P<0.01), B组有丝分裂的肾小管细胞数量明显高于A组. 另B组的巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞浸润较A组减少（表1）.

    3讨论

    肾缺血是引起急性肾衰（ARF）的原因，在肾移植中是不可避免的，而缺血引起的急性肾衰大部分是可以恢复的，但发生严重肾损伤时则不能完全恢复［5］，缺血再灌注损引起的急性肾衰与移植肾的慢性进行性损伤及远期移植肾失功有着密切的关系［1］. HGF具有潜在的促进肾脏组织重建的功能［6-7］. 但外源性的HGF是极不稳定的，因此注射HGF无法达到有效的治疗效果［8］. HGF基因转染治疗是临床治疗的需要. 基因电转染方法大大提高了无病毒基因的转染率，获得了高水平的基因表达，该基因转染方法避免了以病毒为载体引起的致瘤性、细胞毒性及免疫抑制作用，已得到广泛的认识. 目前较多采用的方法是活体肌肉电转染，而肾移植具有肾脏离体灌流的机会，若将hHGF基因直接电转染进入肾脏将会获得更好的治疗效果，因此，我们通过对肾脏和肌肉活体电转染hHGF基因，比较并观察该基因对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用，从而为移植肾的缺血再灌注损伤寻找一种体外器官治疗的方法.

    我们发现，大鼠肾脏转入有效的质粒后可以产生hHGF蛋白. 大鼠血清和肾脏的hHGF表达说明基因转染是有效的. 急性肾衰的发生包括：肾功能衰竭、急性肾小管坏死（合并细胞凋亡和细胞脱落）和炎症（炎细胞浸润）. 我们通过hHGF基因的电转染治疗，上述情况均得以改善. 治疗组肾功能较非治疗组恢复较快. HGF转基因治疗对肾脏的缺血损伤具有较好的保护作用，表现为治疗组肾小管细胞的凋亡和坏死较轻，同时伴有大量的细胞再生. 我们还发现，治疗组的炎细胞浸润较非治疗组低，显示了hHGF具有抗炎作用. 因此，肾脏直接hHGF基因电转染可能成为防治移植肾缺血再灌注损伤的有效的治疗方法.

【】
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