雷诺昔酚对去势后大鼠松质骨中TNF?α表达及骨密度的影响

【摘要】  　　目的： 选择性雌激素受体调节剂(SERM)—雷诺昔酚(RAL)对去卵巢大鼠骨密度及松质骨中TNF?α表达的影响. 方法： 将8月龄未经产雌性二级SD大鼠30只，随机分为假手术(SHAM)组、去势 (OVX)组、去势＋雷诺昔酚(OVX+RAL)组. OVX+RAL组大鼠术后第2日开始给予雷诺昔酚灌胃. 术后20 wk处死各组大鼠，对各组大鼠不同部位骨密度(BMD)进行检测. 利用免疫组织化学染色及用图像分析方法对各组大鼠松质骨切片TNF?α表达图像进行分析，观察RAL对OVX大鼠腰椎松质骨中TNF?α表达的影响. 结果： ① DVX组与SHAM组相比较，TNF?α表达的灰度值降低(P<0.01)；RAL组较OVX组灰度值升高(P<0.01)，表明OVX大鼠松质骨中骨小梁周围及髓腔内TNF?α表达阳性细胞数多于SHAM组；而经RAL后的去卵巢大鼠骨小梁周围及髓腔内TNF?α阳性表达减弱. ② 与SHAM组相比，OVX组股骨近端、股骨干、腰椎BMD降低(P<0.01)；RAL治疗组各部位BMD高于OVX组(P<0.05)，接近SHAM组水平(P>0.05). 结论： RAL可通过抑制破骨性因子TNF?α表达来抑制因雌激素缺乏引起的骨密度降低及骨形态结构退变.

【关键词】  骨质疏松 卵巢切除术 选择性雌激素受体调节剂 雷洛昔芬 骨密度 免疫组织化学 肿瘤坏死因子?α

　　0引言

    绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMO）是一种严重危害人类健康的代谢性疾病，其特点是骨转换加快，成骨与破骨作用失去平衡，骨量减少和骨组织显微结构受损，继而引起骨骼脆性和骨折危险性增加. 以往主要通过雌激素替代疗法来预防和防治PMO，雌激素的骨保护作用主要是抑制破骨细胞的增殖和活性，减缓和抑制骨吸收，并促进成骨作用. 但长期应用会增加乳腺癌和子宫内膜癌的危险性［1-2］，使得雌激素替代疗法防治PMO受到了限制. 雷诺昔酚(RAL)是选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator，SERM)的新一代衍生物，对骨组织具有雌激素样骨保护作用，对乳腺和子宫则具有拮抗雌激素的作用，在防治PMO的同时也避免雌激素替代疗法对机体产生的副作用. 我们通过RAL对去势后大鼠骨质疏松形成过程中骨密度和和松质骨中TNF?α 表达的影响来探讨SERM的骨保护作用机制.

    1材料和方法

    1.1材料Sprague?Dawly雌性大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)；雷诺昔酚片剂(礼来苏州制药有限公司，批号A070647)；兔抗大鼠TNF?α多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）；DPX?IQ型骨密度仪及中小动物软件系统（Lunar公司，美国）；LEICA DM LA显微镜及Leica Q?Win Stander V2.3全自动图像分析系统（Leica公司，德国）. 

    1.2方法

    1.2.1分组和处理8月龄未经产雌性二级SD大鼠30只，体质量（320±25）g，随机分为3组：SHAM组、OVX组、OVX+RAL组，每组10只，组间大鼠体质量无统计学差异. 所有大鼠均以30 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔内注射麻醉，在无菌条件下手术，取背部切口. 分离、结扎、摘除OVX组、OVX+RAL组大鼠双侧卵巢；分离、提出SHAM组大鼠双侧卵巢后，放回腹腔，分层缝合关闭切口. 术后第2日开始将雷诺昔酚片剂碾碎制成浓度为0.3 g/L的生理盐水悬液，按每只1 mg/（kg·d）给RAL组大鼠灌胃. SHAM组、OVX组大鼠按每只3   mL/（kg·d）用生理盐水灌胃. 术后3组大鼠均在二级环境下分笼饲养，给予标准饲料，自由摄水. 3组大鼠均于术后20 wk后处死.

    1.2.2标本采集制备取各组大鼠股骨、腰椎用于测量骨密度. 取L2椎体及股骨髁部进行常规固定、脱钙、梯度乙醇溶液脱水，石蜡包埋、切片，切片厚度4 μm；股骨髁部及部分L2椎体切片进行HE染色，部分L2椎体切片进行免疫组化染色.

    1.2.3免疫组织化学染色① 切片浸入二甲苯、梯度乙醇溶液脱蜡、脱水，在室温下用3 mL/L H2O2溶液中灭活内源性过氧化酶；② 切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，反复加热至沸腾2次，冷却后PBS清洗2次，滴加5 ml/L BSA封闭液，室温下孵育20 min；③ 滴加1∶300兔抗大鼠TNF?α多克隆抗体（Ⅰ抗），在室温下孵育2 h后用0.01 mmol/L PBS清洗3 min×3次；④ 滴加1∶300生物素化山羊抗兔IgG（Ⅱ抗），室温下孵育20 min后，用0.01 mmol/L PBS溶液冲洗2 min×3次；⑤ 滴加SABC试剂，室温下20 min后，用0.01 mmol/L PBS清洗3次；⑥ DAB显色，显微镜下观察有棕黄色物质出现时停止；⑦ 蒸馏水冲冼，苏木素复染细胞核，常规梯度乙醇溶液脱水、二甲苯透明，中性树胶封片.

    1.2.4骨密度测量使用DPX?IQ型7040双能X线吸收测量平台，通过机中小动物软件系统测股骨粗隆部、股骨干中点及第3～5腰椎中点BMD.

    1.2.5图像分析骨组织形态学及骨免疫组织化学观察采用LEICA DM LA显微镜及Leica Q?Win Stander V2.3全自动图像分析系统. 组织形态学观察，光镜下观察L2椎体HE染色切片形态学特征. 采用计算机图像分析系统测定免疫组化染色片中TNF?α表达的平均灰度值. 判定方法：灰度值越小，阳性染色越强，表明免疫反应性越高.

    统计学处理： 采用SPSS11.5软件进行统计分析，所有计量数据均以x±s表示. 组间差异比较采用方差分析及LSD?t检验，P<0.05为有统计学差异.

    2结果

    2.1显微镜下观察椎体松质骨中TNF?α主要分布在骨小粱周围的成骨细胞、骨基质中；胞核及胞质中均有阳性染色；与SHAM组比较，OVX组大鼠松质骨中TNF?α阳性反应明显增强；而RAL组TNF?α阳性表达明显减弱（图1）.

    A：对照组；B：去势组；C：治疗组.

    图1腰椎松质骨TNF?α免疫组织化学染色（抗体稀释度为1∶400；箭头所指为阳性染色SABC ×400）

    2.2图像分析去势组与SHAM组相比较，TNF?α阳性细胞灰度值明显降低［(145±25) vs (182±23) (P<0.01)］，而RAL治疗组TNF?α阳性细胞灰度值高于OVX组［(160±19) vs (145±25) (P<0.01)］.

    2.3BMD测定术后20 wk OVX组与SHAM组比较，皮质骨及松质骨BMD均降低. 股骨近端粗隆部、股骨干、第3～5腰椎BMD均下降（P<0.01,表1）；OVX+RAL组与OVX组比较，股骨近端粗隆部、第4， 5腰椎BMD高于OVX组（P<0.01,表1），股骨干、第3腰椎BMD均高于OVX组（P<0.05,表1），OVX+RAL组与SHAM组比较，股骨近端、股骨干、第3～5腰椎BMD的差异无统计学意义（P>0.05,表1）. 表1各组BMD测定值比较

    2.4骨组织形态学观察腰椎及股骨髁部HE切片光镜下观察见：OVX组骨小梁明显稀疏，皮质骨变薄，小梁及间隙增大，部分区域骨小梁消失；治疗组与OVX组对比，小梁相对丰富，骨皮质较厚，小梁间隔较小，接近假手术组(图2，3).

    3讨论

    TNF主要由单核巨噬细胞产生. 根据来源和结构不同，TNF可分为TNFα, TNFβ.  TNFα是一种强有力的骨吸收诱导剂，可直接促进破骨细胞前体细胞的有丝分裂及破骨祖细胞的分化［3］，并对成熟破骨细胞的骨吸收功能产生促进作用［4］，还间接通过介导基质细胞和成骨细胞表达参与破骨细胞分化所必需的“下游”细胞因子，促进破骨祖细胞的增殖，增强破骨细胞活性［5］. TNF?α对骨代谢的作用受雌激素的调节［6］，雌激素具有抑制绝经后妇女泌尿生殖器官萎缩、抑制骨转换、防止骨丢失、改善绝经后血脂紊乱及记忆力下降（老年性痴呆症）等多种作用；然而，雌激素长期应用会导致子宫内膜和乳腺增殖，增加患子宫内膜癌和乳腺癌的危险性［8］.

    SERM是一类化学结构类似雌二醇人工合成非甾体化合物，其多种衍生物可通过与雌激素竞争结合雌激素受体(ER)发挥作用，对女性生殖系统具有拮抗雌激素的作用，而对骨骼及心血管系统则起保护作用. RAL是SERM新一代的衍生物，有良好的组织选择性，对下丘脑、乳腺和子宫内膜无刺激作用［9］ ，通过选择性结合位于成骨细胞、破骨细胞及骨细胞前体上的ER，刺激成骨细胞，抑制破骨细胞，调控骨的形成、吸收和骨改建［10］.

    去势20 wk后大鼠松质骨中TNF?α 阳性细胞灰度值较SHAM组明显降低（P<0.01），说明去势大鼠松质骨中TNF?α 阳性反应较SHAM组明显增强；RAL治疗组的去势大鼠松质骨中TNF?α阳性细胞灰度值明显高于OVX组（P<0.01），说明经RAL治疗后的去势大鼠松质骨中TNF?α 阳性表达受到了明显抑制；与假手术组相比，OVX组腰椎、股骨近端、股骨干BMD明显下降（P<0.01）；腰椎及股骨髁部骨组织切片观察显示：OVX组骨小梁明显稀疏，皮质骨变薄，小梁及间隙增大，部分区域骨小梁消失；提示去势后大鼠皮质骨、松质骨骨量均明显丢失，经RAL治疗20 wk后的去势大鼠，各部位骨密度无明显减少，松质骨、皮质骨BMD大于单纯去势组（P<0.01或P<0.05）；骨组织学对比，治疗组骨小梁相对丰富，骨皮质较厚，小梁间隔较小，与假手术组接近.

    结合各组大鼠BMD及松质骨中TNF?α阳性灰度值的改变，进一步说明：去势大鼠雌激素水平的降低，使雌激素对TNF?α基因表达的抑制和下调作用减弱，促进了骨吸收的作用，加快了骨质疏松的发生；而RAL起到了类似雌激素的骨保护作用，抑制了去势大鼠松质骨中TNF?α的表达；减弱了由TNF?α 诱导而产生的骨吸收，抑制了因雌激素缺乏引起的骨密度降低及骨形态结构退变. 本实验总体上说明：RAL可通过抑制破骨性因子TNF?α表达来抑制因雌激素缺乏引起的骨密度降低及骨形态结构退变，这可能是SERM抑制绝经后妇女骨吸收及骨质疏松形成的重要机制.

【】
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