酪氨酸激酶Etk的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系

【摘要】  　　目的： 观察酪氨酸激酶Etk的表达与放射引起的鼻咽癌细胞株凋亡之间的关系，探讨Etk对放射引起的鼻咽癌细胞凋亡的调节机制. 方法： 运用免疫荧光技术和流式细胞术检测4株鼻咽癌细胞Etk的表达情况；直线加速器6MV?X射线2 Gy单次剂量照射细胞后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化，以及与Etk,凋亡相关蛋白Bcl?2及Bak表达的关系. 结果： 流式细胞仪检测显示4株鼻咽癌细胞Etk表达水平分别为：5?8F（73.3±3.4）%, 6?10B（50.5±6.1）%,CNE?1（47.7±1.9）%,CNE?2（29.5±1.7）%. 免疫荧光显示，Etk蛋白主要在鼻咽癌细胞胞质中表达，胞核中表达微弱. 统计分析表明，放射线照射后，鼻咽癌细胞株Etk的表达降低，并与细胞的凋亡率及Bak蛋白的表达呈负相关，与Bcl?2的表达无关. 结论： Etk蛋白与放射引起的鼻咽癌细胞凋亡有关，它可能通过调节凋亡蛋白Bak的表达参与了放射后鼻咽癌细胞的凋亡.

【关键词】  鼻咽肿瘤 蛋白质酪氨酸激酶 Etk 细胞凋亡

     0引言

    内皮/上皮细胞酪氨酸激酶 (The endothelial/epithelial tyrosine kinase, Etk)，是蛋白酪氨酸激酶（Bruton?s tyrosine kinase, Btk）家族中惟一一种不仅分布于淋巴造血细胞，还在上皮性瘤细胞和血管内皮细胞中表达的非受体类酪氨酸激酶［1］. 国外研究表明，Etk与T, B淋巴细胞的增殖、分化关系密切，并对乳腺癌、前列腺癌等癌细胞的增殖和凋亡起重要的调节作用［2-3］. 我们最近报道，在鼻咽癌组织中也存在Etk的异常表达，并与EBER?1（EBV Encoded RNA）的表达相关,而与凋亡相关蛋白Bcl?2的表达无关［4］. 本研究我们利用直线加速器对鼻咽癌细胞进行照射，用流式细胞仪检测照射前后细胞的凋亡率及Etk，Bcl?2和Bak的表达，探讨Etk与放射后鼻咽癌细胞凋亡之间的关系及其可能调节机制.

    1材料和方法

    1.1材料兔抗人Etk多克隆抗体购自美国Cell Singnaling公司；FITC标记羊抗兔IgG购自美国CHEMICON公司；兔抗人Bak多克隆抗体及兔抗人Bcl?2多克隆抗体购自福州迈新生物技术公司；Annexin V?FITC 凋亡试剂盒购自美国Beckman Coulter公司；RMPI 1640培养液购自美国GIBCO公司；新生牛血清购自奥地利PAA公司. 细胞株：高成瘤、高转移的低分化鳞癌细胞株5?8F及低成瘤、不转移的低分化鳞癌细胞株6?10B由南方医科大学病研究室馈赠,高分化细胞株CNE?1,低分化细胞株CNE?2由中山医科大学病理学研究室馈赠.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养加入含150 mL/L灭活新生牛血清的RMPI1640培养液，置于37.5℃，饱和湿度50 mL/L的CO2培养箱中培养. 收集融合率70%~80%，存活细胞百分率>95%的对数生长期细胞以备实验.

    1.2.2免疫荧光技术鼻咽癌细胞在预处理过的盖玻片上培养24 h至70%~80%细胞融合，PBS洗涤3次，丙酮冰上固定15 min，洗涤3次后加入兔抗人Etk多抗（稀释浓度1∶100），37℃温育2 h，洗涤后加入FITC标记羊抗兔IgG抗体（稀释浓度1∶50），37℃温育1 h，PBS洗涤后封片，于荧光显微镜下观察.

    1.2.3直线加速器照射产地：美国Varian公司，6MV?X射线，剂量2 Gy，剂量率4 Gy/min ,照射野15 cm×30 cm.

    1.2.4流式细胞仪分析① 鼻咽癌细胞株照射前后Etk的表达：分别收集照射前与照射后6,12 h的鼻咽癌细胞，50 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤后，破膜剂裂解细胞，加入兔抗人Etk多抗（稀释浓度1∶100），孵育1 h，再次洗涤离心，加入FITC标记羊抗兔IgG抗体（稀释浓度1∶50），孵育0.5 h后，在流式细胞仪上检测Etk蛋白的表达，出现绿色荧光的细胞为Etk蛋白表达阳性.    ② 采用上述相同的方法，检测放射线照射前后细胞Bcl?2, Bak蛋白的表达水平. ③ 照射后鼻咽癌细胞的凋亡率：收集照射后12 h的鼻咽癌细胞，PBS洗涤离心后， 1×binding buffer (结合缓冲液)调整细胞浓度为5×109/L，取100 μL与5 μL FITC及2.5 μL PI溶液混匀，冰上避光孵育10 min，加入400 μL 1×binding buffer混匀后，应用美国Becton Dickson 公司的FAC?Sort型流式细胞仪进行分析.

    统计学处理： 数据采用统计软件SPSS10.0，结果用x±s表示，差异比较采用t检验，并进行Spearman相关分析.

    2结果

    2.1流式细胞仪检测照射前4株鼻咽癌细胞Etk表达的阳性率，从高到低依次为： 5?8F（73.3±3.4）%, 6?10B（50.5±6.1）%,CNE?1（47.7±1.9）%,CNE?2（29.5±1.7）%(n＝3）.

    2.2免疫荧光技术检测照射前4株鼻咽癌细胞Etk的表达，荧光显微镜下显示，照射前4株鼻咽癌细胞中均见Etk的阳性表达（绿色），阳性信号主要分布于胞质中，胞核中表达微弱. 各株细胞Etk的表达信号强度与其流式检测的细胞阳性率一致，即信号强度从高到低依次为： 5?8F, 6?10B, CNE?1, CNE?2（图1）.

    2.3流式细胞检测照射后6 h 4株鼻咽癌细胞Etk的表达均下降，Bak与Bcl?2的表达均有升高，但二者的变化程度不如Etk明显. SPSS统计分析表明，4株鼻咽癌细胞照射后6 h Etk的表达与照射前均有统计学差异（P值均<0.05, n=3）；而Bak的表达与照射前均无统计学差异；细胞株5?8F,6?10B在照射后6 h  Bcl?2的表达与照射前无统计学差异，而CNE?1和CNE?2在照射后6 h Bcl?2的表达与照射前有统计学差异（P值均<0.05,n=3,表1）. 照射后12 h鼻咽癌细胞Etk蛋白的表达继续下降，并与细胞凋亡率呈负相关（P<0.01）. 此时除细胞株6?10B外，其余各株细胞Bak的表达与照射前均有统计学差异（P值均<0.05, n=3），并与Etk的表达呈负相关（P<0.01）；凋亡相关蛋白Bcl?2在各细胞株中的表达较照射前升高，差异具有统计学意义（P值均<0.05, n=3），但其表达与Etk的表达无相关（表1）. 表1照射前后鼻咽癌细胞Etk，Bcl?2及Bak表达的变化

    3讨论

    研究发现，酪氨酸激酶Etk与体内许多重要信号传导分子有关，参与了多种肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡过程. 有研究证实，Etk作为下游区的信号分子，参与了表皮生长因子受体(EGFR)介导的乳腺癌细胞凋亡信号的转导途径［7］. Dai等［5］通过裸鼠成瘤实验发现，Etk可促进前列腺癌细胞的致瘤性. 我们通过对4株鼻咽癌细胞进行检测，首次发现在鼻咽癌细胞中，也存在不同水平的Etk蛋白表达，其中高成瘤、高转移株细胞5?8F阳性表达率为（73±3.4）%, 低成瘤、低转移株6?10B阳性表达率为（50.5±6.1）%,提示Etk的表达可能与鼻咽癌细胞的致瘤性及转移性有关，与Dai等［5］的研究一致.