浸润性乳腺癌组织中E?cadherin和CD44v6表达及DNA倍体分析

                                   作者：马春梅 蒋敏 李敏 刘伟 朱艳芳 陈永林

【摘要】  　　目的： 探讨浸润性乳腺癌组织中E?cadherin（E?cad）和CD44v6的表达及DNA倍体，并分析其临床病意义. 方法： 应用免疫组化SP法、组织化学Feulgen染色及图像分析技术检测103例浸润性乳腺癌组织中E?cad和CD44v6蛋白的表达及DNA倍体. 结果： 浸润性乳腺癌E?cad阳性表达率为35.0％(36/103)，E?cad表达与组织学分级、组织浸润程度、腋窝淋巴结转移、复发、远处转移密切相关（P＜0.05）. CD44v6阳性表达率为76.7％(78/103)，其表达与组织学分级、组织浸润程度、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、复发、远处转移密切相关（P＜0.05）. E?cad阴性和CD44v6阳性表达的浸润性乳腺癌多为异倍体癌；E?cad阳性和CD44v6阴性表达的多为2倍体癌（P＜0.05）. 结论： E?cad的低表达与CD44v6的高表达可能参与乳腺癌的侵袭与转移；DNA异倍体可作为对乳腺癌预后的判断指标之一.

【关键词】  乳腺肿瘤 E?钙粘着糖蛋白 CD44v6 免疫组织化学 异倍体

      0引言

　　浸润和远处转移是导致乳腺癌临床失败的主要原因. 因此，阐明乳腺癌的浸润、转移机制显得尤为重要. 随着对肿瘤分子机制的深入研究，发现黏附分子E?cadherin(E?cad)和CD44v6蛋白的表达与肿瘤浸润、转移密切相关［1］. 恶性肿瘤的重要特征之一就是细胞无限制的生长，细胞DNA含量及分布的异常是其生长的物质基础. 所以细胞DNA含量的测定对判断肿瘤性质、预后具有重要意义［2］. 我们通过观察E?cad和CD44v6在浸润性乳腺癌的表达，以探讨二者与乳腺癌各病理、临床指标间的关系及与DNA倍体的相关性，为判断乳腺癌进展及预后提供指标.

    1材料和方法

    1.1材料兰州大学第一病理科手术切除女性乳腺癌标本103例，年龄23～76（平均48.2）岁. 依据WHO标准进行组织学分型：浸润性导管癌72例，管内癌为主的浸润性导管癌11例，浸润性小叶癌7例，髓样癌13例. 56例有随访记录，其中年龄≤50岁21例，＞50岁35例；肿瘤直径≤3cm者12例，＞3cm者44例；无腋窝淋巴结转移患者11例，1～3个转移患者16例，＞3个转移者29例；局部复发14例，远处转移20例. SP试剂盒、鼠抗人E?cad和CD44v6单克隆抗体均购自福州迈新生物技术公司.

    1.2方法

    1.2.1 E?cad和CD44v6表达标本经40 g/L甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，连续4 μm薄切片，分别作HE、免疫组化染色及Feulgen DNA染色. 免疫组织化学染色采用SP法，操作步骤按说明书进行. 以已知阳性切片作阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗. 按照Bloom?Richardson标准进行组织学分级；组织浸润程度按肿瘤边界清楚度进行分级；无腋窝淋巴结转移为（-）组，1～3个腋窝淋巴结转移为（+）组，＞3个为（?）组；CD44v6以细胞质/膜出现棕色颗粒为阳性细胞，E?cad计细胞膜棕染为阳性细胞，根据阳性细胞百分率和染色深浅度的乘积分级：阴性（-）、阳性（+）、强阳性（?）.

    1.2.2DNA倍体分析DNA倍体分析采用Feulgen染色，依据欧洲分析病理学会（ESACP）1995年提出的标准化方案改进，石蜡切片脱蜡、梯度乙醇入水后用1 mol/L盐酸水溶液于60℃处理8 min，后入Schiff液在室温下暗处反应45 min，亚硫酸水溶液洗涤1 min×3次，流水冲洗，常规脱水封片. 采用Video Pro32图像分析系统对Feulgen染色切片的癌细胞进行DNA含量检测，每例检测100个癌细胞核积分吸光度（IA）值. 同时，检测同一切片30个淋巴细胞的IA，以淋巴细胞的平均（P50）IA值作为二倍体（2C）的对照值. 2C（二倍体）＜1.25×P50，3～4C≥（1.25～2.25）×P50，5C≥（2.25～2.75）×P50. ＞5C的细胞作为异倍体细胞. DNA含量用DNA指数（DI）表示，DI=肿瘤细胞核IA均值/淋巴细胞核IA均值. 二倍体DI=0.90～1.10，大于或小于此值为异倍体. DI值不在0.90～1.10范围，并且有＞5C的细胞，作为判定异倍体的标准.

    统计学处理:  应用SPSS10.0统计软件对资料进行统计学处理，组间均数比较用t检验，率的比较用χ2检验. 以P＜0.05为差别有统计学意义.

    2结果

    2.1E?cad和CD44v6表达E?cad与 CD44v6在浸润性乳腺癌组织的表达与组织学分级及组织浸润程度均有密切关系(P＜0.05），与组织学类型无关（P＞0.05,表1）. 在56例有随访记录的患者中，E?cad表达与年龄、肿瘤大小、生存时间无关（P＞0.05），与淋巴结转移、复发、远处转移有关系(P＜0.05）；CD44v6表达与年龄无关（P＞0.05），与肿瘤大小、淋巴结转移、复发、远处转移、生存时间均有关系（P＜0.05,表1). E?cad与 CD44v6在浸润性乳腺癌组织的阳性表达率分别为35.0%(36/103),76.7%(79/103)，在同一癌组织中二者表达呈负相关.  表1浸润性乳腺癌E?cad和CD44v6表达与临床病理指标的关系

    2.2DNA异倍体在E?cad表达阳性的乳腺癌组织中DNA异倍体率为36.1%(13/36)，表达阴性者异倍体率为91.0%(61/67)；CD44v6表达阳性癌组织中异倍体率为82.3%(65/79)，表达阴性者异倍体率为45.9%(11/24)，经χ2检验阴、阳性组之间有统计学差异 (P＜0.01）. 在E?cad表达阴性、CD44v6表达阳性癌组织DI和＞5C值均高于E?cad表达阳性、CD44v6表达阴性癌组织 (表2). 表2CD44v6和E?cad表达与DNA含量的关系   

　　3讨论

    　　E?cad是一类介导细胞间相互黏附的钙依赖型跨膜糖蛋白，参与形成和维持正常细胞的极性和组织构架，E?cad蛋白突变和低钙环境可导致细胞解离. 在许多肿瘤中均发现E?cad的表达减少或下调，被认为是抑制肿瘤转移的因素［3-4］. 肿瘤细胞浸润、转移的过程首先是黏附和去黏附的过程，癌细胞侵袭转移首先是由于细胞间同质黏附降低，细胞从原发瘤体分离的结果. 分化良好的癌组织E?cad表达多正常，癌细胞之间保持了较好的连接状态，浸润生长较为少见，相反，E?cad表达下降的癌组织中，癌细胞之间的黏连松散，肿瘤细胞易于脱落离开原发灶而发生浸润和转移. 本研究显示，在浸润性乳腺癌中，E?cad的阳性表达降低，并与肿瘤的分化程度、转移潜能和预后有一定关系，与有关报道一致［5-6］. 对其DNA倍体的分析表明E?cad表达阴性的乳腺癌DI值和＞5C值均高，提示E?cad表达阳性患者预后较好，E?cad表达的改变可作为一种评价肿瘤转移潜能的指标. CD44是一族广泛分布于各种组织细胞表面的跨膜糖蛋白，参与细胞间、细胞与基质间的特异黏附过程. 在本实验中，CD44v6在浸润性乳腺癌中高表达，并且与组织浸润程度、组织学分级、腋窝淋巴结转、局部复发、远处转移、生存时间等病理临床学指标之间密切相关. 同时研究表明CD44v6阳性表达与DNA含量（DI）呈正相关，提示CD44v6可作为乳腺癌浸润、转移的预后指标. 结果还提示CD44v6表达与乳腺癌的组织学分级关系密切，而组织学类型之间差异不明显，因而认为组织学分级较单纯分型对判断预后更有意义. E?cad是介导细胞同质型的黏附分子，而CD44v6 是介导细胞异质型黏附的主要分子. 本研究显示，浸润性乳腺癌组织中 E?cad蛋白表达与 CD44v6蛋白表达之间存在负相关，这与Kallakury等［7］研究结果相一致，表明浸润性乳腺癌易于浸润、转移可能与两者的表达失衡有关.

    　　DNA异倍体的出现是染色体异常的表现，肿瘤细胞核DNA含量是反映肿瘤恶性程度和生物学行为的重要指标. 细胞DNA含量及分布的异常不但加速了细胞分裂增殖，同时导致细胞内特异性多肽和蛋白的合成失败，使细胞不能从增殖状态转变为分化状态. 本实验中，在E?cad阴性、CD44v6阳性表达的乳腺癌多为异倍体癌；E?cad阳性、CD44v6阴性表达者多为二倍体癌. 说明E?cad阴性、D44v6阳性癌增殖活性高于E?cad阳性、CD44v6阴性癌，进一步提示E?cad, CD44v6可作为乳腺癌的判断预后指标. 联合检测E?cad和CD44v6蛋白表达和DNA倍体对乳腺癌诊断和判断预后具有一定的意义.

【文献】
  ［1］ Ponta H, Sherman L, Herrlich PA. CD44: From adhesion molecules to signalling regulators ［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003, 4(1):33-45.

［2］ Wachulska M, Kozlowska K, Cichorek M. The DNA ploidy and proliferative activity of transplantable melanoma cells in regard to their secretory function［J］. Neoplasma, 2005,52(4): 280-286.

［3］ 张阿丽，王全胜，陈刚，等. Snail与E?cadherin在上皮性肿瘤中的表达及其临床意义［J］. 肿瘤, 2006, 26(5): 469-471.

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［5］ Hoteiya T, Hayashi E, Satomura K, et al. Expression of E?cadherin in oral cancer cell lines and its relationship to invasiveness in SCID mice in vivo［J］. J Oral Pathol Med, 1999,28(3):107-111.

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［7］ Kallakury BV, Sheehan CE, Ross JS. Co?downregulation of cell adhesion proteins alpha? and beta?catenins, p120CTN, E?cadherin and CD44 in prostatic adenocarcinomas ［J］. Hum Pathol, 2001, 32(8): 849-855.