胰岛素样生长因子对早期胚胎发育的保护作用

                作者：张米娜，于月成，黄侃，宋晖，张红菊，王晓红

【关键词】  早孕

    Protective effect of insulinlike growth factors on early pregnancy

　　【Abstract】 AIM: To detect the expressions of insulinlike growth factorⅠ (IGFI) in villus and IGFII in decidua and the levels in mother serum, and to explore their relationship with the embryogenesis of early pregnancy. METHODS: Expressions of IGFI and IGFII were examined by immunohistochemical SP method; the mRNA expressions of IGFI and IGFII were detected by in situ hybridization (ISH); serum IGFI and IGFII levels were determined by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: The expressions of IGFI and IGFII both protein and mRNA were lower in the abnormal villus and decidua of pregnancy termination than those of normal villus and decidua of normal pregnancy （P<0.01）. Serum levels of IGFI and IGFII in normal pregnancy women were much higher than those of abnormal pregnancy women（P<0.01）. CONCLUSION: IGFI and IGFII may play important roles in the regulation of fetal growth, the decrease of IGFI and IGFII levels in villus, decidua and serum may be the key factor contributing to the embryogenesis termination of early pregnancy. So IGF I and IGFII can serve as 2 parameters in examining the fetal safety.

　　【Keywords】 insulinlike growth factor I; insulinlike growth factor II; early pregnancy;  villus termination; deciduas

　　【摘要】 目的：探讨胰岛素样生长因子I和II（IGFI和II）在正常胚胎发育及早期胚胎发育终止绒毛及蜕膜组织中的表达及其在母体血中水平的改变与胚胎发育的关系. 方法：分别采用免疫组织化学SP法和原位杂交法检测正常胚胎发育绒毛及早期胚胎发育终止绒毛中IGFI和蜕膜中IGFII蛋白的表达以及IGFI mRNA和蜕膜中IGFII mRNA的表达；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测正常妊娠及早期胚胎发育终止孕妇血中IGFI和II水平的变化. 结果：免疫组化结果显示，正常妊娠绒毛中IGFI和蜕膜中IGFII的表达明显高于胚胎发育终止组（P＜0.01）；原位杂交结果显示，正常妊娠组绒毛中IGFI和蜕膜中IGFII mRNA的表达明显高于胚胎发育终止组（P＜0.01）；正常妊娠组母血中IGFI和II水平显著高于胚胎发育终止组（P＜0.01）. 结论：IGFI和II在绒毛组织中的表达及母血中的水平的升高对早期胚胎发育有重要的保护作用，其含量的减少可能是导致胚胎死亡的重要原因之一. IGFI和II可能成为预测胎儿安危的指标之一.

　　【关键词】 胰岛素样生长因子I； 胰岛素样生长因子II； 早孕； 绒毛；蜕膜

　　0引言

　　近年来已有大量研究表明胚胎在宫内的生长发育是一个多因素调节的过程. Guidice等［1］证实胰岛素样生长因子I（IGFI）具有调节胎儿生长发育的作用，但是有关具体作用途径和作用机制尚不清，而子宫内膜中胰岛素样生长因子II（IGFII）的含量随月经周期而改变，并与卵巢激素的作用密切相关［2-3］，因此，推测IGFs在早期胚胎发育过程中可能起着重要作用. 我们通过检测正常胚胎发育孕妇及胚胎发育终止孕妇血中的IGFI水平和绒毛中的IGFI及蜕膜中IGFⅡ表达的变化，探讨IGFI和IGFⅡ对早期胚胎发育的保护作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料选取200309/200410西京妇产科门诊48例经B超证实胚胎发育终止而行清宫术者的绒毛组织和蜕膜组织为实验组，56例因避孕失败而实施人工流产的绒毛组织和蜕膜组织为对照组. 两者妊娠天数均小于84 d. 入选对象均为健康女性，年龄(24±2.8)岁. 兔抗人IGFI和II多克隆抗体及通用型超敏SP试剂盒（北京百灵克试剂公司）；IGFI和II检测试剂盒（DSL公司）；IGFI和II原位杂交试剂盒（武汉博士德试剂公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1母血中IGFI和IGFII含量的检测术前均空腹抽取静脉血3 mL，不抗凝，离心后取血清， -20℃冷冻冰箱保存. 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，操作方法严格按照试剂盒说明进行. 反应终止后在EL312e型酶标仪测吸光度值，每份标本均测双份，取平均值，根据标准曲线算出IGFI和II含量.

　　1.2.2绒毛组织中IGFI和蜕膜组织中IGFII的表达采用免疫组织化学SP染色法检测. 将绒毛组织和蜕膜组织经40 g/L多聚甲醛固定后，常规制作4 μm石蜡切片，一抗为兔抗人IGFI和II抗体（1∶100）,二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，以DAB显色. 具体步骤按说明书进行. 对照设置：免疫组化染色中分别以已知IGFI阳性的肝癌和IGFII阳性的乳腺癌作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照. 检测结果的判定：以胞质中出现黄色和棕黄色颗粒为阳性信号.

　　1.2.3绒毛组织中IGFI mRNA和蜕膜组织中IGFII mRNA水平的表达采用原位杂交法检测. 将石蜡切片常规脱蜡至水，加30 mL/L H2O2室温处理10 min，用DEPC水洗2×5 min. 加胃蛋白酶于37℃消化30 min，以0.5 mol/L PBS洗3×5 min，于40℃预杂交3 h. 用滤纸吸去预杂交液，然后杂交过夜，最后用DAB显色. IGFI和II mRNA探针为地高辛标记的原位杂交液，一抗为HRP标记的鼠抗地高辛IgG. 对照设置：以试剂盒内配置的阳性切片（肝癌）作为阳性对照，以不加含有标记探针的原位杂交液作为阴性对照. 检测结果的判定：以胞浆中出现黄色和棕黄色颗粒为阳性信号.

　　1.2.4图像分析用MIAS300型图像分析仪，输入装置为Olympus BH2显微镜和产MTV180型CCD摄像头，显微放大倍数400倍，普通光源照明. 将免疫组化染色和原位杂交染色切片显微镜下观察视野输入图像分析仪的高分辨图像监视器上，对阳性产物相对含量进行测定. 在光镜下（×100）每例随机取样测5个蜕膜断面，10个单位面积，每组共测50个单位面积，每个单位面积阳性产物的相对含量. 取其平均值代表该切片阳性物质的相对含量.

　　统计学处理： 数据以x±s表示，采用SPSS 12.0统计软件，组间比较用t检验，P<0.05表示有统计学意义.

　　2结果

　　2.1母血中IGFI和IGFII的含量ELISA检测结果表明，对照组（正常妊娠）母血中IGFI含量为（194±145）μg/L，IGFII含量为（184±15）μg/L；而实验组母血中IGFI含量为（125±13）μg/L，IGFII含量为（125±13）μg/L；二者之间差异显著（P<0.01）.

　　2.2绒毛组织中IGFI和蜕膜组织中IGFII的表达免疫组化检测结果表明，IGFI在对照组的绒毛组织中的表达以阳性及强阳性为主；而在实验组中的表现阴性和弱阳性为主. IGFII在对照组中的表达以阳性和强阳性为主；而在实验中的表达则以阴性和弱阳性为主.两组之间差异显著（P<0.01,表1,图1）.

　　表1绒毛组织中IGFI，IGFI mRNA和蜕膜组织中IGFII，IGFII mRNA的表达（略）

　　bP＜0.01  vs对照.

　　图1绒毛组织IGFI（A）和蜕膜组织IGFII（B）的阳性表达(表达在胞质和胞膜上)SP ×400（略）

　　2.3绒毛组织IGFI mRNA和蜕膜组织IGFII mRNA的表达原位杂交检测结果表明，IGFI mRNA在对照组的绒毛中表现为强阳性；而在实验组中表现为阴性和弱阳性；IGFII mRNA在对照组的蜕膜中表现为强阳性；而在实验组中表达为阴性和弱阳性. IGFI和II mRNA在对照组的阳性产物含量明显高于实验组（P<0.01，表1，图2）.

　　图2绒毛组织IGFI Mrna (A)和蜕膜组织IGFII mRNA (B)的阳性表达(表达在胞质和胞膜上)ISH ×400（略）

　　3讨论

　　胚胎是动物个体发育的重要阶段，多种生长因子和激素在胚胎生长发育过程中起了重要的调控作用，其中IGFs被证明是胎儿生长过程中重要的调节因子［4］. IGFs是1957年发现的具有类似胰岛素原代谢活性和结构特征的低分子肽类物质，它是一种具有同化作用的生长因子，能增加葡萄糖和氨基酸的吸收，抑制蛋白质降解，刺激各种细胞的增殖和分化［5］.

　　IGFI不仅可直接刺激胎儿的神经系统、骨骼、血液系统和内分泌系统等的发育，还可通过改善胎盘功能，调节胎盘血流转运，增加胎盘对营养物质的摄取，从而促进胎儿生长［6］.  本研究结果表明正常妊娠组IGFI的表达阳性率均明显高于胚胎发育终止组，且母血中IGFI的含量在正常妊娠组也显著高于胚胎发育终止组，说明胚胎发育早期IGFI蛋白保持较高的表达不但与早期胚胎的正常发育密切相关，而且还是维护正常胚胎和胎盘的生长所必需. IGFII在细胞滋养层细胞的侵入、分化和胎盘形成过程中以自分泌方式发挥重要作用. 在妊娠的前3 mo，IGFII对早期合体滋养层增殖和（或）分化起自分泌调节作用，在孕6 wk左右，IGFII即随绒毛外合体滋养层渗透和侵入到母体蜕膜，提示IGFII可能在滋养层侵入中发挥调节作用［7］. Lpoez等［8］发现缺乏IGFII基因的裸鼠胎盘海绵体滋养层糖原合成与糖原细胞数量较正常组显著下降，提示IGFII在胎盘中可调控糖原合成及糖原细胞的量，是糖原合成的重要调节器; 人类IGFII作用与其相似，如胰岛素一样刺激葡萄糖在胎盘的转运及合成，对胎盘的形成与功能有显著影响，从而进一步影响胎儿的生长发育. 本研究结果表明正常妊娠组IGFII的表达阳性率均明显高于胚胎发育终止组，且母血中IGFII 的含量在正常妊娠组也显著高于胚胎发育终止组，说明胚胎发育早期IGFII蛋白保持较高的表达不但与早期胚胎的正常发育密切相关，而且是早期胚胎发育是重要调节因子之一.

　　Somi等［9］学者发现整个妊娠期间胎盘组织分泌的IGFII量是IGFI的近10倍，而我们的研究与此不一致，IGFI，IGFII分泌量结果相当. 提示在维持胎盘生长过程中，IGFI和IGFII作用相似，检测血中IGFI，IGFII的含量可能作为判断胚胎发育状况的一项客观生化指标，不仅可能用于胎儿在宫内发育是否正常的监测，也为应用外源性胰岛素样生长因子流产、早产和胎儿宫内发育迟缓（IUGR）等妊娠疾病提供了理论依据.

　　【】

　　［1］ Guidice LC, Irwin JC. Roles of the insulinlike growth factor family in nonpregnant human endometrium and at the decidual: Trophoblast interface［J］. Semin Reprod Endocrinol, 1999, 17(1):13-21.

　　［2］ Giudice LC, Dsupin BA, Jin IH, et al. Differential expression of messenger ribonucleic acids encoding insulinlike growth factors and their receptors in human uterine endometrium and decidua［J］. J Clin Endocrinol Metab, 1993, 76(5):1115-1122.

　　［3］ Gao JG, Zhu HH, Fan J, et al. Progestin and antiprogestin differentially regulate the expression of insulinlike growth factors (IGFI and IGFII) messenger ribonucleic acid in human endometrial stromal cells［J］. Biol Reprod, 1995, 53(2):355-360.

　　［4］ Allan GJ, Flint DJ, Patel K.  Insulinlike growth factor axis during embryonic development ［J］. Reproduction, 2001, 122(1):31-39.

　　［5］ Stwart CE, Rotwein P. Growth differentiation and survival: multiple physiological functions for insulinlike growth factors［J］. Physiol Rev, 1996, 76(4):1005-1026.

　　［6］ 陈其新, 毛鑫智. 胰岛素样生长因子对胚胎生长发育的作用［J］. 动物医学进展, 2001,22(1):34-37.

　　［7］ Baker J, Liu JP, Elizabeth EJ, et al. Role of insulinlike growth factors in embryonic and postnatal growth［J］. Cell, 1993, 75(1):73-82.

　　［8］ Lopez MF, Dikkes P, Zurakowski D. Insulinlike growth factor II affects the appearance and glycogen content of glycogen cells in murine placenta［J］. Endocrinology, 1996, 137(5):2100-2108.

　　［9］ SchaferSomi S. Cytokines during early pregnancy of mammals: A review［J］. Anim Reprod Sci, 2003, 75(12):73-94.