反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定

               作者：许朱定，宋振顺，安家泽，李韧，张福琴，窦科峰

【关键词】  ,基因表达

    Construction and identification of recombinant eukaryotic expression vector of human antisense cortical actinassociated protein gene

　　【Abstract】 AIM: To construct a recombinant eukaryotic expression vectorpcDNA3.0/cortactin containing functional region of human antisense cortical actinassociated protein gene (cortactin), so as to provide a tool for the further study on the impact of cortactin in hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis. METHODS: Total RNA was extracted by using Trizol onestep method from cell line MHCC97. CDNA was amplified using reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). Product of PCR, amplified by being transformed into E.coli Dh5α, was inserted reversely into the eukaryotic expression vector after digestion and ligation using restriction endonucleases and ligase. RESULTS: The correct cortactin cDNA clone was obtained and it was confirmed that cortactin cDNA was inserted  reversely into the eukaryotic expression vector correctly using PCR, digestion identification and sequencing. CONCLUSION: The recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.0/cortactin is successfully constructed.
 
　　【Keywords】 gene expression; highly metastatic HCC cell line MHCC97; reverse transcriptase polymerase chain reaction; human cortical actinassociated protein (cortactin)

　　【摘要】 目的： 构建一个包含人皮层肌动蛋白（cortactin）反义基因的全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin，为进一步研究人皮层肌动蛋白对人肝癌细胞的转移影响的研究奠定基础. 方法： Trizol试剂法提取体外培养的人肝癌高转移细胞株MHCC97总RNA，经逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）扩增目的片段，PCR产物及真核表达载体分别双酶切后进行连接，并转化入大肠杆菌Ecoli.Dh5α扩增以获得重组载体. 结果： RTPCR获得预期大小的特异性DNA片段，经PCR、双酶切鉴定及测序证实已将人皮层肌动蛋白基因cDNA片段正确的反向插入真核表达载体中. 结论： 成功获得反义pcDNA3.0/cortactin重组质粒.
 
　　【关键词】 基因表达；高转移肝癌细胞MHCC97；逆转录聚合酶链反应；人皮层肌动蛋白cortactin

　　0引言
 
　　原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一, 其侵袭转移和术后复发是患者死亡的主要原因. 目前国内外对肝癌转移机制研究逐步深入. 最近人们发现人皮层肌动蛋白cortactin基因对于肿癌的转移有重要的促进作用.为此，我们利用反义核酸技术构建真核表达载体pcDNA3.0/cortactin，为后续的研究将该基因片段转染入肝癌细胞株，观察该基因在肝癌细胞株中的表达情况，并对转染后的细胞功能进行研究作好准备.

　　1材料和方法

　　1.1材料高转移肝癌细胞MHCC97购自上海复旦大学中山肝癌研究所；大肠杆菌Ecoli. Dh5α，真核表达载体pcDNA3.0由第四军医大学分子生物学教研室吴元明博士惠赠. 高糖型DMEM培养液为 Invitrogen公司产品；新生牛血清系北京元亨圣马生物技术研究所产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料技术有限公司产品；胰蛋白酶(Trypsin)为北京原平皓生物技术有限公司产品；胰蛋白胨(Tryptone)及酵母提取液（Yeast Extract）为OXLID公司产品；琼脂（Agar）为Sanland公司产品；琼脂糖（Agarose）为上海Yito公司产品；Trizol试剂、Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶（XhoI, BamHI）、pMD 18T载体、Trizol试剂为Takana公司产品；胶回收试剂盒为BioDev公司产品；质粒小量抽提试剂盒为Vgene公司. PCR引物： 根据Gene Bank中查到的cortactin的mRNA序列，用软件Primer Premier5.0设计上下游引物，引物序列如下（划线部分分别是BamHI和XhoI的碱基识别序列，斜体部分为保护序列）：上游引物5′ATACTCGAGGTGGAACAAGACCGAATGGA3′；下游引物 5′TAGGATCCATCCCAGCCAAGGGCACATT3′.
 
　　1.2方法

　　1.2.1高转移肝癌细胞MHCC97培养将购回的细胞经2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，培养于含100 mL/L胎牛血清的高糖型DMEM完全培养液中，置于37℃含50 mL/L CO2的孵箱中培养，每3 d换液1次，直至铺满.
 
　　1.2.2总RNA的提取用2.5 g/L胰蛋白酶消化培养铺满的肝癌细胞MHCC97，PBS洗涤后转移至1.5 mL微量离心管中，离心1000 g离心10 min，弃上清，加入1 mL Trizol试剂，立即反复抽吸至细胞充分裂解，静置5 min，加入200 μL氯仿剧烈振荡15 s，低温离心机4℃ 12000 g离心20 min，取水相至一新的微量离心管中，加入等体积的异丙醇，4℃静置60 min，低温离心机4℃ 12000 g离心20 min，弃上清，750 mL/L乙醇洗涤沉淀2次、4℃ 5000 g离心10 min，弃上清，沉淀干燥3 min，加入15 μL无Rnase水溶解沉淀. 取5 μL行凝胶电泳； 2 μL用于反转录.
 
　　1.2.3反转录合成cDNA根据反转录试剂盒的说明用随机六聚体法反转录合成cDNA. 将反应体系置于冰上，取总RNA 2 μL+引物(随机六聚体)1 μL+去离子水9 μL于PCR反应管中，轻轻混匀，在PCR反应仪中70℃静置5 min；放置冰上，依次加5×Buffer 4 μL, Rnase抑制剂1 μL和dNTP 2 μL，轻混匀，25℃ 5 min；立即冰浴后加入反转录酶1 μL（终体积20 μL），轻混匀后依次进行25℃ 10 min, 42℃ 60 min, 70℃ 10 min和立即冰浴. 取cDNA进行PCR.
 
　　1.2.4PCR扩增目的片段cortactin基因在PCR反应管中建立50 μL反应体系： Buffer 5 μL, MgCl2 3 μL, Sense  2.5 μL, Antisense 2.5 μL, cDNA 4 μL, dNTP 2 μL, ddH2O 31 μL；并用50 μL矿物油封. 热启动94℃, 4 min后加Taq酶 0.5 μL. 反应条件为： 94℃预变性4 min后，95℃变性30 s，56℃退火2 min，72℃延伸2 min，共35个循环，72℃再延伸7 min. 最后4℃保存. 产物行凝胶电泳. 目的片段切胶按胶回收试剂盒说明行胶回收纯化. -70℃保存.
 
　　1.2.5目的片段与T载体连接在0.5 mL PCR反应管中建立如下10 μL连接反应体系： pMD 18T Vector DNA 1 μL，目的片段胶回收产物3 μL，去离子水1 μL, Solution I 5 μL, 16℃反应2 h. 将全量连接产物转化至感受态细菌100 μL中；在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上37℃培养12 h，形成单菌落. 挑取少许摇菌，37℃, 200 r/min振摇扩增过夜.

　　1.2.6.1PCR法鉴定重组T载体中连接有目的片段取1 mL振摇扩增过夜的菌液，4000 g离心10 min，弃上清；菌液沉淀加100 μL水重悬并煮沸10 min裂解细菌；12000 g离心10 min，取上清于新的微量离心管中；取4 μL作为模板进行目的片段的PCR反应. 反应产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳.
 
　　1.2.6.2重组T载体双酶切鉴定将经PCR鉴定阳性的克隆进行扩增摇菌，按质粒抽提试剂盒说明进行提质粒.质粒进行双酶切鉴定，限制性内切酶为XhoI, BamHI. 37℃双酶切6 h，并70℃ 15 min灭活双切酶；产物行10 g/L琼脂糖电泳鉴定.
 
　　1.2.6.3目的片段的测序鉴定如经PCR及双酶切鉴定均证实目的片段已连入T载体. 可取阳性克隆菌液100 μL，交上海华大基因公司测序鉴定.
 
　　1.2.7目的片段与线性质粒pcDNA3.0的连接将测序正确的连接有目的片段的重组T载体及pcDNA3.0分别进行双酶切，双酶切反应体系同前，产物行凝胶电泳，切取目的片段及线性质粒胶回收纯化. 目的片段及线性质粒按3∶1比例建立连接反应体系， 16℃反应2 h，将全量(10 μL)连接产物转化至感受态细胞100 μL中；在含有Amp的LB琼脂平板培养基上37℃培养12 h，形成单菌落. 摇菌扩增，抽提质粒.
 
　　1.2.8重组质粒pcDNA3.0/cortactin（+）的双酶切鉴定微量离心管中依次加入去离子水11 μL, 10×K Buffer 2 μL, BamHI及XhoI各1 μL，最后加入重组质粒pcDNA3.0/cortactin（+） 5 μL, 37℃双酶切6 h. 产物行10 g/L琼脂糖电泳鉴定.

　　2结果

　　2.1提取的总RNA凝胶电泳分析见28, 18和5S  3条不同的明亮条带，说明提取的总RNA的完整性良好. 对RNA样品进行紫外分光光度分析得出A260/A280>1.8，表明RNA有较高的纯度，符合反转录的要求.
 
　　2.2目的片段PCR产物进行凝胶电泳在500 bp处有明亮特异条带，与预期结果一致（图1）.

　　2.3重组pMD 18T/cortactin（+）的鉴定

　　2.3.1PCR鉴定在500 bp处有明亮特异条带，与预期结果一致（图2），初步表明目的片段连接上重组T载体.
 
　　2.3.2双酶切鉴定双酶切结果行凝胶电泳，在500 bp处及大于2000 bp处分别有明亮条带（图2），表明cortactin基因已连接入T载体.

　　图1目的片段cortactin基因的PCR产物凝胶电泳结果（略）

　　图2重组pMD 18T/cortactin（+）的PCR及双酶切鉴定凝胶电泳结果（略）

　　2.3.3重组pMD 18T/cortactin（+）的测序鉴定结果与Gene Bank中的cortactin序列进行比对，结果完全一致.

　　2.4重组质粒pcDNA3.0/cortactin（+）的双酶切鉴定凝胶电泳分别于大于5000 bp及500 bp处有明亮条带（图3），表明测序结果正确的cortactin片段连接入pcDNA3.0 中的BamHI和XhoI酶切位点之间，已成功获得重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin（+）.

　　图3重组质粒pcDNA3.0/cortactin（+）的双酶切鉴定凝胶电泳结果（略）

　　3讨论

　　肝细胞肝癌(HCC)是目前最常见的恶性肿瘤之一，尽管诊断和技术取得了很大的进步，但是肝癌的高复发性仍是当前肝癌治疗工作中的一个难点和重点，而目前对肝癌术后复发的主要防范措施是术后的介入性化疗和大剂量长时间的干扰素治疗，疗效仍不满意［1］. 肝细胞肝癌的侵袭和转移包括了基质的降解、细胞迁移、血管生成等一系列步聚［2］，Yuan等［3］在头颈部肿瘤、膀胱癌、乳腺癌中的研究表明肿瘤的迁移运动能力加强能促进肿瘤的扩散与转移.
 
　　Cortactin是一个p80/85的蛋白，为Src蛋白激酶的作用底物［4］. Somogyi等［5］通过研究果蝇的皮层肌动蛋白发现该蛋白位于细胞的表面或两极；蛋白间相互作用机制类同于哺乳动物的皮层肌动蛋白，参与细胞骨架（cytoskeleton）的重组与黏附［3］,因而得名. cortactin基因EMS1，位于染色体11q13，该区域在头颈部肿瘤、膀胱癌及乳腺癌等中均有扩增,Chuma等［4］研究发现在转移性肝癌细胞株中均有cortactin的过表达，且该蛋白位于细胞的表面，故有望将此蛋白作为单克隆抗体治疗肝癌的靶向蛋白.
 
　　本实验利用反义核酸技术，根据碱基互补原理，合成一段与靶DNA互补的短链寡核苷酸，反向插入真核表达载体pcDNA3.0的BamHI和XhoI酶切位点之间，构建真核表达载体pcDNA3.0/cortactin（+）. 本实验通过对培养细胞进行Trizol一步法提取总RNA，反转录合成cDNA，目的片段连入T载体后经PCR、双酶切及测序鉴定等方法保证了插入真核表达载体pcDNA3.0序列的正确性. 并对重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin（+）进行双酶切鉴定，证实构建成功.

　　【】

　　［1］ 易述红，陈规划，许戈良，等. 奥曲肽诱导大鼠肝部分切除术后种植性肝癌细胞凋亡的研究［J］. 中华肝胆外科杂志，2004,10(6):411-413.
 
　　［2］ 王伟，杨连粤，杨治力，等. 自分泌运动因子受体和RhoC基因在肝细胞癌侵袭转移中的作用［J］. 中华肝胆外科杂志，2004，10（6）：408-410.

　　［3］ Yuan BZ, Zhou X, Zimonjic DB, et al. Amplification and overexpression of the EMS1 oncogene, a possible prognostic marker, in human hepatocellular carcinoma ［J］. J Mol Diagn, 2003,1:48-53.
 
　　［4］ Chuma M, Sakamoto M, Yasuda J, et al. Overexpression of cortactin is involved in motility and metastasis of hepatocellular carcinoma ［J］. J Hepatology, 2004,41:629-636.

　　［5］ Somogyi K, Rorth P. Cortactin modulates cell migration and ring canal morphogenesis during Drosophila oogenesis ［J］. Mech Dev, 2004,121:57-64.