醋酸棉酚对白血病HL
【关键词】 细胞凋亡
Effects of gossypol acetic acid on apoptosis and differentiation in leukemia HL60 cells
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of gossypol acetic acid(GAA) on apoptosis and differentiation in classic human actue promylocytic leukemia cell line HL60 and study the possibility to treat leukemia with it. METHODS: The cytotoxic activity of GAA on HL60 cells was detected by means of MTT assay. Apoptosis was identified and analyzed with the help of transmission electron microscopy, cell cycle, and DNA gel electrophoresis, etc. The differentiation of HL60 cells into more mature granulocytes was detected by nitro blue tetrazolium (NBT) reduction test. RESULTS: More than 6 μmol/L GAA could suppress the proliferation and induce the apoptosis in HL60 cells in a dosedependent manner. NBT reduction test demonstrated that HL60 cells could also be induced to differentiate into more mature granulocytes by lowdose GAA (1, 4 μmol/L, P<0.05). CONCLUSION: GAA could selectively induce the apoptosis of leukemia HL60 cells in a smaller dose than that for human peripheral blood mononuclear cells, which suggests that it may be an ideal drug for leukemia therapy.
【Keywords】 gossypol; HL60 cells; cell division; apoptosis; cell differentiation
【摘要】 目的： 通过醋酸棉酚（GAA）对经典白血病细胞系HL60的研究，探索GAA白血病的可能性. 方法： 用细胞培养、四唑盐比色试验（MTT）、细胞形态学、DNA电泳及NBT还原试验等方法观察不同浓度GAA促进HL60细胞凋亡及诱导分化的作用. 结果： GAA在浓度>6 μmol/L时可显著抑制HL60细胞的增殖，促进其凋亡，并表现出剂量效应；在诱导分化浓度下（1, 4 μmol/L），GAA可促进HL60细胞向成熟粒细胞分化(P<0.05). 结论： GAA对白血病细胞HL60的选择性促凋亡作用表明其可能是一种理想的高效低毒抗白血病药物.
【关键词】 棉酚；HL60细胞；细胞分裂；细胞凋亡；细胞分化
0引言
白血病发病率有显著升高的趋势［1］. 近年来，多酚类药物的抗肿瘤作用日益受到重视［2］. 作为多酚类药物的一分子，棉酚天然存在于锦葵科某些植物的根、茎、种子中，其化学结构为2, 2′联二萘8, 8′二羧基醛1, 1′, 6, 6′, 7, 7′六羟基5, 5′二异丙基3, 3′二甲基，分子质量为518.54，具有多种生物学活性［3］. 然而，以往曾经报道棉酚的抗肿瘤作用却未得到多数学者的认可. 近年随着研究的深入，其显著的抗肿瘤作用又重新得到了人们的重视［4］. 棉酚对白血病细胞的作用效果如何，有无临床使用价值？我们通过使用其衍生物醋酸棉酚（GAA）对经典的白血病HL60细胞系进行研究，观察其对HL60细胞增殖、分化的影响.
1材料和方法
1.1材料人急性白血病HL60细胞系由本室保存. 正常人单个核细胞（PBMNCs） 来自第四军医大学西京输血科正常献血员供血离心白细胞层. RPMI 1640 （Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料研究所）. GAA、四唑氮蓝（MTT）及硝基蓝四氮唑（NBT）购自Sigma公司. 显微镜（日本JEOL公司）；酶联免疫检测仪（美国BioRad公司）；流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司）.
1.2方法
1.2.1试剂准备用二甲基亚砜（DMSO）溶解GAA，浓度为12.5 mmol/L，过滤除菌，分装，-20℃保存备用. RPMI 1640按说明配制. FBS于 56℃ 30 min灭活，分装，-20℃冻存备用. MTT用0.01 mmol/L PBS配制成浓度5 g/L溶液， NBT用9 g/L生理盐水配成为2 g/L溶液，分别过滤除菌，避光4℃保存备用.
1.2.2细胞培养HL60细胞以1×108/L密度接种于含100 mL/L FBS的RPMI 1640培养基，置37℃, 50 mL/L CO2，饱和湿度的孵箱培养，每3～4 d传代1次. 将正常献血员分离的白细胞层用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离，收集PBMNCs，经RPMI1640培养液洗涤，调整到所需细胞浓度培养［5］.
1.2.3不同浓度GAA抑制HL60细胞增殖的作用GAA浓度从100 μmol/L开始. 以含同样梯度浓度DMSO的PRMI 1640培养基为平行孔. 将HL60细胞以4×104/孔接种于96孔培养板中，每孔体积100 μL. 培养24 h后按倍比稀释浓度梯度加入GAA，继续培养. 每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，终止培养，离心吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO震荡10 min，使结晶物充分溶解. 用酶联免疫检测仪检测A490 nm. 以浓度为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线并半数抑制浓度值（IC50）［6］. 检测GAA对PBMNCs的作用方法同上，接种密度为1.5×105/孔.
1.2.4超微结构观察将终浓度为20 μmol/L的GAA作用于对数生长期的HL60细胞，24 h后收获细胞，PBS洗涤2次，转移至Eppendorf管，1500 r/min离心15 min. 40 mL/L戊二醛固定，电子显微镜观察.
1.2.5流式细胞仪检测细胞周期将终浓度为20 μmol/L的GAA作用于对数生长期的HL60细胞，16 h后收获细胞，PBS洗涤2次，700 mL/L冷乙醇固定. 流式细胞仪检测细胞周期.
1.2.6DNA梯度电泳按［7］进行，将终浓度为20 μmol/L的GAA作用于对数生长期的HL60细胞，24 h后收获细胞，PBS洗涤2次，裂解缓冲液混匀，加入蛋白酶K 56℃消化过夜，酚氯仿抽提，冷乙醇沉淀，TE溶解. 18 g/L琼脂糖凝胶50 V电压电泳1 h，观察DNA ladder.
1.2.7形态学观察根据MTT实验结果选用1 μmol/L与4 μmol/L作为GAA诱导分化用浓度. 在含100 mL/L FBS的RPMI 1640, 4×107/L的HL60细胞培养体系中加入不同浓度的GAA培养5 d，将细胞离心涂片，WrightGiemsa染色，油镜下观察细胞形态.
1.2.8NBT还原试验将用终浓度1 μmol/L与4 μmol/L的GAA处理的HL60细胞培养1~5 d. 收集细胞，以不含血清的RPMI 1460洗涤离心，弃上清，每管加2 g/L NBT 0.5 mL和0.1 mL 佛波酯（TPA）200 mg/L溶液，摇匀，37℃反应30~60 min. 吸取少量细胞悬液，涂片，空气干燥，常规WrightGiemsa染色. 以细胞质出现蓝紫色斑者为阳性. 随机在光学显微镜下观察200个细胞，计算阳性百分率.
统计学处理： 实验结果以x±s表示，各组间差异采用方差分析. 半数抑制浓度（IC50）的计算采用SPSS统计软件包的Probit回归分析完成.
2结果
2.1GAA对人白血病HL60细胞系增殖的影响随着GAA浓度的升高，GA对HL60细胞表现出明显的抑制增殖作用. 说明GAA对HL60细胞有着明显的浓度依赖效应（图1）.
图1不同浓度的GAA对HL60细胞生长的影响（略）
2.2GAA对PBMNCs增殖的影响当GAA>12 μmol/L时，GAA才对PBMNCs表现出明显的杀伤效应. 提示GAA对正常PBMNCs的作用浓度要显著高于对白血病细胞作用浓度，提示GAA对白血病细胞存在明确的选择杀伤作用（图2）.
图2不同浓度的GAA对PBMNCs细胞生长的影响（略）
2.3电子显微镜超微结构观察大量的细胞表现出染色质边集等凋亡现象（图3）.
图3大量的20 μmol/L终浓度GAA处理24 h后的HL60细胞表现出染色质边集等凋亡现象TEM ×7500（略）
2.4流式细胞仪观察细胞周期检测结果提示出现明显的亚G1凋亡峰（图4）.
图420 μmol/L终浓度GAA处理16 h后HL60细胞，有明显的亚G1凋亡峰（略）
2.5梯度DNA电泳可见明显的DNA ladder形成，提示GAA可以促进HL60细胞凋亡（图5）.
2.6GAA对HL60细胞的诱导分化作用形态学观察结果表明： 阴性对照组HL60细胞体积大，外形不规则；核大，染色质疏松细致，可见多个核仁，核质比例大. 经GAA处理的HL60细胞形态产生明显变化，细胞体积变小，核染色质浓缩，核质比例变小，胞质呈灰蓝色，原始细胞减少. NBT还原试验结果显示，1 μmol/L与4 μmol/L GAA处理的HL60细胞NBT还原试验阳性率呈时间依赖性增高，并与剂量有关(P<0.05). 1 μmol/L与4 μmol/L浓度GAA处理5 d的HL60细胞NBT还原试验阳性率分别为34%和45%(P<0.05，表1）.
2.7IC50经，GAA对HL60细胞的IC50值为9.4 μmol/L，而对PBMNCs的IC50值为48.0 μmol/L.
1: 100 bp marker; 2: 20 μmol/L浓度GAA作用16 h后可见少量的ladder; 3: 20 μmol/L浓度GAA作用24 h后可见明确的ladder.
图5GAA作用后HL60细胞DNA电泳图（略）
表1低浓度GAA对HL60细胞诱导分化后NBT还原试验阳性率（%）变化（略）
aP<0.05 vs空白对照, cP<0.05 vs 1 μmol/L GAA.
3讨论
目前临床用于白血病的化疗药物包括烷化剂、抗代谢药、抗生素及激素等. 这些药物不仅毒副作用较强，对骨髓抑制作用明显，而且在长期使用后会逐渐产生耐药性，导致失败. 作为天然药物的棉酚具有显著的抗实体瘤作用，且副作用较小. 体外研究提示该药物对多种肿瘤细胞系有着明显的抗增殖和抗转移作用，如乳腺癌、直肠癌、肝癌、黑素瘤等. 在24 h以上的细胞存活实验中，对于黑素瘤，棉酚的活性要大于顺铂、马法兰、达卡巴嗪等. 还有人将该药物用于治疗进展期的胶质瘤和难治性肾上腺癌、乳腺癌等患者，均取得了令人满意的效果，但均缺乏进一步的深入研究［4］. 棉酚口服后部分被小肠吸收，大部分经胆汁分泌，主要代谢场所是肝脏. 其生物半衰期为48 h，各组织活性依次为胃肠道、肝脏、心脏、肾脏、血液、肌肉等. 因此，口服棉酚后能维持较长时间的有效血药浓度［8］. 提示棉酚比多数经典的化疗药物有着更显著的抗肿瘤活性，很有希望应用于临床治疗白血病. 我们的结果表明，GAA在＞6 μmol/L的浓度范围对HL60细胞有着显著的抑制增殖、促进凋亡作用，且与作用剂量有关，表现出明显的剂量依赖效应. 发现对于正常PBMNCS, GAA的有效抑制浓度要明显高于对HL60细胞的抑制浓度，说明GAA对白血病细胞有选择性杀伤作用.
恶性肿瘤的发生与肿瘤细胞增殖和分化之间的平衡失调有关，表现为增殖失控而分化受阻. 许多药物如维甲酸及某些天然成分可以促进白血病细胞向成熟分化，这也是目前治疗白血病的措施之一［9］. 可见，许多天然药通过诱导白血病细胞分化来发挥抗白血病作用. 在分化诱导剂作用下，HL60细胞可向成熟粒细胞分化，表现为NBT 还原试验阳性［10］. 我们的结果发现，在体外培养体系中，1 μmol/L与4 μmol/L的GAA均能使HL60细胞形态发生改变，NBT还原试验阳性率也明显增高，呈时间与剂量依赖关系. 这表明在诱导分化剂量下，GAA可促使HL60细胞向成熟粒系分化. 通过诱导白血病细胞向成熟粒细胞分化，从而抑制其增殖，这可能也是GAA抗白血病作用的机制之一.
与传统的化疗药物相比，棉酚的副作用就显得简单易于处理. 过去在用于节育目的长期服用时发现主要表现为低钾血症、个别患者睾丸生精上皮的严重损伤等，但发生率仅为1%左右，且临床处理也较容易，而且相对于致命的白血病来说，这些副作用显得微不足道. 而且长期口服治疗剂量的棉酚不会引起骨髓抑制，这相对其他治疗白血病的化疗药物而言具有无法比拟的优势［11-12］. 更为重要的是，其代谢产物氧化棉酚同样具有显著的抗肿瘤作用，甚至比其原体活性还高. 以上特点表明，棉酚是一种非常有前途的新型抗肿瘤药物［13-14］.
我们的研究结果表明，GAA对白血病细胞具有选择性杀伤及诱导分化作用，提示其可能成为一种新型、高效低毒的抗白血病药物.
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