Nogo

               作者：武肖娜，李容，李静雯，鞠躬

【关键词】  细胞分化

    Effects of NogoC on  differentiation and neurite extension of PC12 cells

　　【Abstract】 AIM: To study the effects of NogoC on the differentiation and neurite extension of PC12 cells. METHODS: The expression of NogoC in NGFtreated PC12 cells was detected using RTPCR and immunofluorescence. And pEGFPN1NogoC, the GFPtagged NogoC vector was transfected into PC12 cells. The effects of NogoC on the differentiation and neurite extension of PC12 cells were further studied by cell counting. RESULTS: A small amount of NogoC mRNA could be detected in NGFtreated PC12 cells; NogoC was found to be expressed in NGF treated PC12 cells by immunofluorescence; the neurite extension of NGFtreated PC12 cells transfected with NogoC was significantly increased according to the results of cell counting. CONCLUSION:  NogoC was expressed in NGFtreated PC12 cells, and overexpressed NogoC would facilitate the differentiation and influence the neurite extension of NGF treated PC12 cells.

　　【Keywords】 overexpression;  NogoC; PC12 cells; cell differentiation

　　【摘要】 目的： 利用PC12细胞研究NogoC和神经元细胞分化及突起生长的关系. 方法： NGF诱导PC12细胞，利用RTPCR及免疫荧光技术检测细胞内NogoC的表达，并在PC12细胞中过表达NogoC，通过细胞计数检测NogoC对突起生长的影响. 结果： ① RTPCR检测到NGF诱导的PC12细胞中有少量NogoC的mRNA分子表达；② 免疫荧光染色观察到NGF诱导的PC12细胞中有少量NogoC的表达；③ 细胞计数观察到转染NogoC后的PC12细胞在NGF诱导后突起增长百分数相对于EGFP组明显增高. 结论： NGF诱导的PC12细胞中有NogoC的表达，同时过表达NogoC可促进NGF诱导下的PC12细胞的分化以及影响细胞的突起生长.
 
　　【关键词】 过表达；NogoC；PC12 细胞；细胞分化

　　0引言

　　Nogo分子是影响成年哺乳动物中枢神经再生最重要的抑制因子之一［1-2］，已证明作为Nogo分子中最小的选择性剪接体NogoC在中枢神经系统（CNS）神经元中表达［3-4］. 利用RTPCR, Northern Blot等手段证明了PC12细胞中表达NogoA, NogoB的mRNA，但RTPCR并没有检测到PC12细胞中有NogoC mRNA的表达. 用Northern Blot可以检测到NGF诱导后的PC12细胞中有少量NogoC mRNA表达［5］. 这些研究均提示NogoC与神经元的分化相关. 我们以PC12细胞为神经元模型，研究NogoC在神经元细胞的分化及突起生长中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料 大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞系购自院上海细胞生物研究所. 绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pEGFPN1购自Clontech公司；编码人NogoC的cDNA 克隆进pEGFPN1构建成pEGFPN1NogoC［4］. Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)、胎牛血清、马血清、 OPTIMEM、脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000、TRIZAL等购自Gibco/Invitrogen 公司. 胰酶、NGF、购自Sigma公司. BcaBestTM RNA PCR Kit Ver 1.1试剂盒和DNA marker购自TAKARA公司. RabbitantiRat/Human NogoC多克隆抗体购自Chemicon公司. 荧光二抗Texas Red donkey antirabbit IgG购自Molecular Probes公司. PCR引物由生工生物工程技术服务有限公司合成，新生1 d SD大鼠仔鼠由第四军医大学实验动物中心提供.
 
　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养PC12细胞使用DMEM培养基(添加50 mL/L 的胎牛血清和100 mL/L 的热灭活马血清)，置于37℃, 50 mL/L CO2的培养箱中培养，每隔48 h传代1次. 使用100 μg/L NGF的低血清DMEM培养基（含10 mL/L 的胎牛血清）对PC12细胞进行诱导分化3 d.
       
　　1.2.2转染及其诱导收获处于对数生长中期的PC12细胞进行接种，24 h后使用LipofectamineTM 2000转染质粒pEGFPN1及pEGFPN1NogoC，4 h后换完全培养液；需要进行诱导分化的细胞，在4 h后换100 μg/L NGF的低血清DMEM培养基，培养3 d后用于后续实验.
 
　　1.2.3RNA的提取和纯化及RTPCR使用TRIZOL试剂分别抽提正常PC12细胞、NGF诱导的PC12细胞以及作为阳性对照的新生1 d的SD大鼠仔鼠大脑皮层的RNA. 调整RNA浓度至25 mg/L，进行RTPCR. 大鼠NogoC的PCR引物［6］: 上游引物为5′GAAATGGACGGACAGAAGAAAC 3′，下游引物为5′CACATCAACACTGCAAACTTCA3′，扩增401 bp的片段. 大脑皮层PCR反应条件为: 96℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环. 细胞的PCR反应条件为: 96℃ 30 s, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min, 35个循环. PCR产物使用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统采图观察.
 
　　1.2.4免疫细胞化学染色将正常的PC12细胞以及NGF诱导的PC12细胞，使用40 mL/L多聚甲醛固定15 min 后，在-20℃预冷的甲醇中固定30 s，使用驴血清封闭20 min, RabbitantiRat/Human NogoC (1∶18)染色1 h，PBS清洗后，入Texas Red donkey antirabbit IgG荧光二抗1 h，PBS再次清洗后，甘油封片.使用荧光显微镜(Olympus BX60)观察并采图.
 
　　1.2.5细胞计数将细胞分为NogoCEGFP组、EGFP组及正常PC12细胞组，通过细胞计数各组细胞的突起生长率. 以1×104个/孔的密度接种于24孔板中进行转染和诱导，在荧光显微镜(200×)镜下，每组随意取十个视野细胞采图，计数十个视野中带绿色荧光细胞的总数（对转染pEGFPN1NogoC的PC12细胞，能看到具有明显GFP定位的细胞为阳性并进行计数），及有效诱导的绿色荧光细胞的数量，计算阳性细胞突起生长率（有效诱导的绿色荧光细胞数/绿色荧光细胞总数×100%）. 有效诱导的细胞以突起生长为标准：突起长度大于胞体的二倍或二级突起长度大于2 μm. 每组设三个复孔，重复三次实验. 实验结果以x±s表示. 组间比较采用方差分析及LSDt检验，P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　2.1RTPCR在NGF诱导后的PC12细胞以及大脑皮层中扩增得到条带位置相同，约400 bp大小的片段,与预期大小相符，而在正常PC12细胞中没有得到相同的片段(图1).

　　2.2免疫荧光检测在NGF诱导后的PC12细胞中可以观察到表达很弱的红色荧光，具体的细胞内分布尚不清楚. 而在未诱导的PC12细胞中观察不到红色荧光（图2）.

　　图1NogoC的mRNA在正常的PC12细胞、NGF诱导的PC12细胞和大脑皮层中的表达情况（略）

　　A： 无NGF作用的PC12细胞；B： NGF诱导的PC12细胞（箭头所指处为阳性）. （bar=50 μm）

　　图2NogoC抗体的免疫细胞化学染色（略）

　　2.3细胞计数经过细胞计数、计算发现，在NGF诱导下转染pEGFPN1NogoC的PC12细胞中具有GFP明显定位的细胞，其突起生长率为（31.7±1.5）%，明显高于EGFP组（21.3±2.8）%（P<0.05），差别具有统计学意义；而相对于正常PC12细胞（30.4±2.4）%没有明显差别（P>0.05，图3）.

　　aP<0.05 vs EGFP组（x±s, n=9）.

　　图3各组细胞的突起生长率（略）

　　3讨论

　　由于启动子和剪切方式不同，Nogo基因主要编码NogoA, NogoB和NogoC 3种不同的蛋白质［5,7-9］.作为Nogo分子中最小的选择性剪接体NogoC，也被证明在中枢神经系统分裂后的神经元中表达［3-4］. NogoC尽管具有轴突生长抑制性结构域Nogo66，但其具体功能尤其在CNS中的功能目前还不清楚. 功能研究发现NogoA和NogoB基因剔除小鼠的实验尽管没有表现出明显的神经再生发生，但同时剔除NogoA, NogoB和NogoC，则可导致胚胎大部分致死［10］. 这些研究提示NogoC与神经元的成熟和分化可能相关.
 
　　PC12细胞系大鼠肾上腺来源的嗜铬细胞瘤细胞克隆，是目前广泛用来研究神经元的分化发育、突起生长和递质释放的一种细胞系. 而NGF诱导可使PC12细胞停止分裂并开始向包括突起生长的神经元方向分化. 有研究显示NGF可促进PC12细胞内的cyclin1增加，并可以通过提高细胞内p21来抑制cdk激酶的活性，这对于诱导PC12细胞分化并导致细胞周期阻滞于G1期具有重要意义［11-12］.
 
　　本研究利用RTPCR及免疫荧光技术发现在被NGF诱导的PC12细胞中有少量 NogoC的表达，可能是由于NGF在诱导PC12细胞向神经元分化的同时还存在对NogoC基因的转录调节. 由于NogoC抗体限制，目前还不能进一步用Western Blot的方法对细胞内NogoC蛋白的表达进行鉴定. 我们认为转染NogoC的PC12细胞的细胞周期可能在G1期到S期的过程中发生阻滞，此时细胞也可能已经处于分化状态. 通过对带突起的细胞计数和，发现异位表达NogoC的PC12细胞相对于正常细胞并没有明显促进突起生长的作用，但是两组与EGFP组比较均有明显差异，所以，我们可以说在一定程度上NogoC具有拮抗有关抑制PC12细胞突起生长的作用.
 
　　我们以PC12细胞为神经元模型，研究NogoC对神经元细胞的分化及突起生长的影响. 利用RTPCR以及免疫荧光技术发现NGF诱导的PC12细胞中有NogoC的表达，同时，异位表达NogoC可以阻滞PC12细胞的细胞周期并影响其突起生长，提示NogoC可能对神经元的分化和突起生长具有重要的作用.

　　【】

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