水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

【关键词】  毕赤酵母

    Secretory expression of hirudins in Pichia pastoris

　　【Abstract】 AIM: To construct hirudin expression vectors and obtain its secretory expression in Pichia pastoris(P. pastoris). METHODS: Hirudin HV2 and HV2N47K genes were amplified by PCR and the correct genes were fused to pPIC9 α factor signal and subcloned into pPIC9K secretory expression vector. The constructs were transformed into P. pastoris strain GSM1168, stable multicopy integrants were screened on medium containing increasing concentrations of G418. Then the screenedout clones were induced by methanol to express hirudin proteins. The supernatants of expression products were identified by SDSPAGE and Western blot analysis, and its antithrombotic activity was determined too. RESULTS: The expression vectors were successfully constructed, hirudins were expressed in supernatants of P. pastoris, and the expression products possessed antithrombotic activity. CONCLUSION: Hirudins can be  expressed secretorily in P.  pastoris, which offers a basis for newdrug researches.
 
　　【Keywords】 hirudin; Pichia; secretory expression

　　【摘要】 目的： 构建水蛭素毕赤酵母表达载体，获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法： 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2N47K基因，将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游，再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K，构建表达质粒pPIC9KHV2, pPIC9KHV2N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168，G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株，经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果： 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体，获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达，表达产物具有抗凝血酶活性. 结论： 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达，为研究新药奠定了基础.

　　【关键词】 水蛭素；毕赤酵母；分泌表达

　　0引言

　　水蛭素(hirudin)是从水蛭（Hirudo medicinalis）中分离出的抗凝血活性成分，是凝血酶的天然抑制剂［1］，具有高效的抗血栓形成作用和非常广阔的应用前景［2-3］. 但是天然水蛭素来源匮乏，限制了其研究和临床应用，我们以水蛭素HV2, HV2N47K的氨基酸序列为对象，通过PCR扩增得到了目的基因，克隆入毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达载体pPIC9K中，构建了水蛭素酵母分泌型表达载体，转化SMD1168毕赤酵母细胞并进行诱导表达，获得了具有抗凝血酶活性的表达产物，为水蛭素的研究及临床应用奠定了基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料质粒pPIC9, pPIC9K, Top10F菌株及毕赤酵母菌SMD1168由本实验室保存. TaKaRa Taq酶，限制性内切酶（EcoRI, XhoI, BamHI, Sa1I），T4 DNA连接酶均购自宝生物公司. 发色底物Chromozym TH及ECL化学发光检测试剂盒购自Roche公司，鼠抗hirudin单抗(mAb) 购自AntibodyShop公司，酵母基因组DNA纯化试剂盒购自上海华舜生物工程公司. 电泳仪、电转仪均为BioRad公司产品. 引物合成及DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成.
 
　　1.2方法

　　1.2.1水蛭素基因的获取根据水蛭素HV2的氨基酸序列，按照［4］方法，采用分段合成寡核苷酸片段，互补寡核苷酸片段的退火配对后，进行PCR扩增而获得HV2基因. HV2N47K是经过DNA改组和噬菌体亲和筛选获得的具有较高抗凝血酶活性的水蛭素变异体［5］，HV2N47K基因经PCR从pCANTAB5EHV2N47K载体中获取. 用于PCR扩增的上游引物P1：5′ CTCTCGAGAAAAGAATTACTTAC 3′，引入XhoI酶切位点，下游引物P2：5′GGGAATTCCTATTGTAAATATTC 3′，引入EcoRI位点. PCR扩增参数： 94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，共进行30个循环. 扩增的PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定.
 
　　1.2.2酵母表达载体的构建将PCR产物用EcoRI和XhoI双酶切，回收目的片段，插入经相同酶切的pPIC9载体，转化宿主菌TOP10F，提取质粒，酶切鉴定含有全长HV1基因的重组子，并将其送上海生工生物工程公司测序. DNA测序正确后(命名为pPIC9HV1)，再经BamHI, SalI酶切后定向插入毕赤酵母表达载体pPIC9K，得到高拷贝表达载体pPIC9KHV2.

　　1.2.3酵母菌的转化及高拷贝整合菌株的筛选挑取GSM1168单菌落接种于10 mL YPD中，30℃振荡过夜，1%体积转接至100 mL YPD中扩大培养至A600=1.0；菌液于4℃，1000 g离心5 min，菌体依次用50 mL预冷的去离子水和10 mL预冷的1 mol/L山梨醇洗涤，最后将细胞重悬于1.0 mL预冷的山梨醇溶液中. SalI线性化的pPIC9KHV1及空载体pPIC9K各10 μg分别与100 μL酵母细胞混匀，加入电转杯，冰浴5 min，BioRad电转仪转化，电击结束后立即加入1 mL预冷的1 mol/L的山梨醇溶液，混匀. 取0.5 mL转化物涂布于MD（13.4 g/L YNB, 4×10-4 g/L Biotin, 20 g/L Dextrose, 20 g/L琼脂，1 mol/L山梨醇）选择平板上，30℃培养2~4 d，观察转化子的生长. 再将MD平板上生长的阳性克隆依次转种至含1, 2, 3, 4, 5 g/L G418的MD平板上，以在高浓度G418上正常生长的菌落为高拷贝整合菌株. 挑取高拷贝整合单菌落进行扩增，提取其基因组DNA，分别用P1和P2引物进行PCR扩增.
 
　　1.2.4表达菌株的培养及诱导表达取鉴定的单克隆菌株于2 mL YPD中，30℃ 250 r/min摇床培养过液，再以1%的量接种于10 mL BMGY培养液(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，10 g/L甘油，13.4 g/L YNB, 0.4 mg/L生物素，0.1mol/L磷酸钾缓冲液) 中，于30℃, 250 r/min的摇床上培养至A600为4~8. 离心收集菌体，弃去BMGY培养基，更换为20 mL BMMY培养液(10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液，13.4 g/L YNB， 0.4 mg/L生物素，5 mL/L甲醇) 于30℃诱导表达，每24 h加入甲醇0.1mL（终浓度为50 mL/L, V/V）并取样，离心收集上清进行SDSPAGE鉴定.
 
　　1.2.5表达产物的分析表达菌株经诱导培养后，取表达上清进行15%的SDSPAGE电泳，用转印仪将蛋白转移到PVDF膜上，用封闭液37℃处理膜2 h，漂洗后加人兔抗人酸性成纤维细胞生长因子的多克隆抗体于37℃孵育1 h. 用PBS漂洗后，加入鼠抗hirudin mAb和HRP羊抗鼠IgG室温孵育1 h，用ECL化学发光底物压片曝光，显影后观察结果.
 
　　1.2.6表达产物的活性检测取诱导表达的酵母上清液50 μL，凝血酶50 μL（60  U/L）加入到1 mL反应缓冲液（50 mmol/L TrisHCl pH 8.3， 0.2 mol/L  NaCl）中，37℃保温5 min，加入发色底物Chromozym TH, 405 nm波长下测定表达产物的活性，结果以每分钟A值的变化△A405/min表示.

　　2结果

　　2.1水蛭素基因的获取参照水蛭素HV2的氨基酸序列，分段合成的寡核苷酸片段磷酸化后，互补配对的碱基经退火形成双链DNA，经PCR扩增，获得约220 bp的基因片段；同理，经PCR从pCANTAB5EHV2N47K载体中扩增，获得HV2N47K基因片段（图1）.

　　1: HV2基因PCR结果；2: HV2N47K基因PCR结果；3: pPIC9HV2；4: pPIC9HV2N47K；5: pPIC9；6: pPIC9KHV2；7: pPIC9KHV2N47K；8: pPIC9K；M: DL2000 DNA分子量标准；λ: λ HindIII酶切片断.