醛固酮受体拮抗剂对大鼠肝纤维化的影响

【关键词】  肝星状细胞

    Effect of aldosterone receptor antagonist on hepatic fibrosis of rats

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of aldosterone receptor antagonist on the synthesis of collagen and the activation of hepatic stellate cells in rats. METHODS: Ninety SD rats were randomly divided into 3 groups: control group (n=8) were fed normal food and injected with peanut oil, sc; liver fibrosis model group (n=42) were induced by 400 mL/L CCl4, 3 mL/kg peanut oil, sc, twice a week and fed maize powder combined with highfat and highprotein diet; spironolactone preventing group (n=40) were given 100 mg/kg spironolactone, besides, the methods of making models were the same as those of the model group. Blood was taken from eyes and the levels of HA, LN, PCⅢ and CIV were examined. Liver tissues were stained with HE and VG.  Tissue morphological change was examined with light microscopy. The degree of hepatic fibrosis was assessed by an image analyze system. Moreover, the expression of αSMA in hepatic tissue was detected with immunohistochemical methods.  RESULTS: The levels of HA, LN, PCⅢ and CIV in spironolactone group were greatly lower than those in model group (P<0.05). Histological observation indicated that the grade of fibrosis and the area of collagen in rats of the model group were significantly higher than those of the spironolactone group (P<0.05); The expression of αsmooth muscle actin in hepatic tissue in spironalactone group was significantly lower than that of the model group (P<0.05). CONCLUSION:  Spironolactone can inhibit the formation of liver fibrosis in rats. Spironolactone may prevent the formation of hepatic fibrosis through inhibiting the activation of hepatic stellate cells.

　　【Keywords】 spironolactone; liver cirrhosis; hepatic stellate cell; αsmooth muscle actin

　　【摘要】 目的： 探讨醛固酮受体拮抗剂螺内酯对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化及胶原合成的影响. 方法：用CCl4花生油、高脂和低蛋白复合因素制造大鼠肝纤维化模型. 90只SD大鼠随机分为3组. 对照组8只：单纯花生油sc，正常饮食；模型组42只：400 mL/L CCl4,花生油3 mL/kg,sc，2次/wk，饲以单纯玉米粉并高脂、高胆固醇饮食造模；螺内酯预防组40只：造模的同时予以螺内酯100 mg/kg灌胃1次. 眼球采血检测血中透明质酸（HA）, Ⅲ型前胶原（PCⅢ）, IV型胶原（CIV）和层粘蛋白（LN）含量，肝组织HE, VG染色，光镜下观察组织学改变，图像分析仪测量胶原面积；免疫组化法观察螺内酯对肝脏平滑肌动蛋白（αSMA）表达的影响. 结果：螺内酯组HA,PCⅢ,CIV,LN水平较模型组明显降低(P<0.05)；光镜下模型组肝纤维组织增生分级及胶原面积均大于螺内酯组(P<0.05)；螺内酯组αSMA在肝组织中的表达较模型组明显减少（P<0.05）. 结论： 螺内酯可减轻大鼠肝纤维化的形成，其机制可能通过抑制肝星状细胞的活化，起到预防肝纤维化的作用.

　　【关键词】 螺内酯;  肝硬化;   肝星状细胞; 平滑肌动蛋白

　　0引言

　　醛固酮合成的前体为脱氧皮质酮，其合成的关键酶,醛固酮合成酶编码基因为CYPⅡB2. 心脏、血管、肺脏、肝脏均表达醛固酮合成所需基因CYPⅡB2，合成醛固酮［1］. 实验证明，肝脏HSC和肺脏Ⅱ型肺泡细胞可表达CYPⅡB2mRNA［2］. 近年研究发现，醛固酮尚参与器官纤维化的形成，而其受体拮抗剂螺内酯可以抑制心肌［3］、血管［4］、肾脏［5］等的胶原合成. 我们观察螺内酯对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化及胶原合成的影响.

　　1材料和方法

　　1．1材料清洁级雄性SD大鼠90只，购自上海BK公司，体质量200～265（平均230）g. 螺内酯（螺内酯片，spironolactone）：江苏黄海制药厂，HA，LN，PCⅢ，CIV放射免疫试剂盒：北京北方免疫试剂研究所；αSMA mAb购自福建迈新生物技术开发公司.

　　1．2方法大鼠试验前自由喂养1 wk，随机分为3组：①正常对照组（8只）：正常饮食饮水，sc花生油，量同模型组；②肝纤维化模型组（42只）：按《中药药理实验方法学》用复合因素造模，实验1 d皮下注射400 mL/L CCl4花生油溶液5 mL/kg，以后每隔3 d注射1次3 mL/kg. 以795 g/kg单纯玉米粉、200 g/kg猪油及5 g/kg胆固醇配成混合饲料，自来水为惟一饮料饲养动物;③螺内酯预防组（40只）：造模方法同上，螺内酯每日100 mg/kg灌胃. 各组每周称体质量1次以调节CCl4用量及螺内酯给药量. 8 wk末处死大鼠. 取肝右叶小块组织用40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，切片. 断头处死前行眼球采血3000 r/min离心15～20 min，取血清-20℃备检. 放免法测定血清HA,LN,PCⅢ,CIV；肝组织切片分别行HE染色和VG染色. VG染色根据汇管区血管周围红染区厚度，将肝纤维化分为0～III级：0级<5 μm；I级5～10 μm；II级10～15 μm；III级>15 μm. 每张切片随机选取3个视野，记录其病理分级，取其平均值作为该动物肝脏的病理分级. 胶原面密度应用CMIAS真彩色医学图象分析系统进行图象分析，根据胶原占视野中肝脏的面积比间接估计胶原含量，每张切片随机选5个视野（其中汇管区占2个），分别计算其面密度(面密度=胶原面积/肝组织视野面积×100%)，取其平均值. 应用免疫组化法观察肝脏平滑肌动蛋白(αSMA)，以PBS替代一抗作空白对照，正常血清替代二抗作替代对照，结果均为阴性，棕黄色为阳性染色.

　　统计学处理： 采用SPSS统计软件分析. 计量资料以x±s表示，均数间比较采用方差分析及SNK法，经检验各组各指标间方差齐同.

　　2结果

　　在实验过程中，模型组和螺内酯组分别有10只和8只大鼠死亡，正常对照组大鼠无死亡，发育良好，活泼好动. 模型组动物精神差，活动少，发育迟缓，皮毛松弛，毛色黯淡，厌食，消瘦，体重明显减轻. 螺内酯组动物健康状况相对较好，皮毛柔顺有光泽.

　　2.1血清学指标与正常组相比，螺内酯组和模型组PCⅢ,HA,CⅣ,LN明显升高（P<0.01）. 与模型组相比，螺内酯组中上述指标明显降低(P<0.05,表1).

　　2.2肝脏病理变化模型组肝组织表面光亮度下降，颜色暗红且边缘不规、质脆、体积缩小、肝表面可见针尖大小颗粒. 螺内酯预防组肝脏体积大致正常、柔软、呈花斑状、未见颗粒. 模型组肝小叶结构破坏，肝细胞变性、坏死明显，大部分假小叶形成，并炎细胞浸润位于结缔组织区域（图1A），纤维化3级. 而螺内酯组肝小叶结构基本正常，肝细胞变性明显，轻度坏死、结缔组织增生及炎细胞浸润, 胶原呈带状增生（图1B），纤维化2级或1级，其胶原面密度小于模型组(P<0.05，表1).

　　2.3αSMA免疫组化分析在正常对照组αSMA只表达于小动脉及小静脉，胆管无表达. 模型组αSMA主要表达于汇管及纤维区间隔，呈长椭圆形或梭形，随肝纤维化，表达逐渐增强. 螺内酯组在汇管及纤维区间隔少量表达，较模型组明显减轻(P<0.05,表1).

　　表1肝纤维化大鼠血清Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、透明质酸、层粘蛋白及胶原含量(略)

　　aP<0.05 vs模型组,bP<0.01 vs正常对照组.
　　
　　3讨论

　　本结果表明，螺内酯组大鼠一般情况较好，死亡率较低. 肝纤维化早期，模型组主要以变性为主，肝细胞坏死及纤维增生较轻，炎细胞浸润较轻；螺内酯组水肿、脂变均较模型组轻. 但后期模型组肝细胞水肿、脂变反倒减轻，主要表现为肝细胞坏死、小叶结构破坏、炎细胞浸润及纤维组织增生显著，纤维分隔包绕，并可见假小叶形成. 而螺内酯组仍以变性为主，肝小叶结构尚存，肝细胞坏死、炎细胞浸润及纤维组织增生均较模型组明显减轻，说明螺内酯有稳定肝细胞膜、减轻炎症及抑制纤维组织增生的作用. HSC是肝脏细胞外基质的主要产生细胞. αSMA表达是HSC的激活的一个重要特征，而HSC的激活是肝纤维化形成的共同通路［6］. 活化的HSC是ECM生成的主要来源，可分泌Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ型胶原、LN、纤维连接蛋白、HA等多种ECM成分［7］. 我们发现，螺内酯组PCⅢ, CⅣ, HA, LN及较造模组明显减少，免疫组化A:模型组； B:螺内酯预防组.

　　图1大鼠造模8 wk肝组织病VG ×100(略)

　　观察到螺内酯组αSMA表达较模型组明显减少,提示螺内酯可减轻肝组织胶原合成，其机制可能通过抑制肝星状细胞的活化，阻断ECM合成的自分泌放大过程，起到预防肝纤维化的作用. 但不清楚螺内酯是通过直接作用还是通过抑制细胞因子而间接抑制了HSC的活化，则需进一步研究.

　　【】

　　［1］ Allan D, Struthers, Thomas M, et al. Review of aldosterone and angiotensin IIinduced target organ damage and prevention ［J］. Cardiovasc Res, 2004, 61(4): 663-670.

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　　［4］ Nehme JA, Lacolley P, Labat C, et al. Spironolactone improves carotid artery fibrosis and distensibility in rat postischaemic heart failure［J］. J Mol Cell Cardiol, 2005, 39(3):511-519.

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