染料木黄酮对卵巢癌HO

【关键词】  卵巢肿瘤

    Inhibitory effect of genistein on human ovarian cancer cell line  HO8910PM in nude mice

　　【Abstract】AIM:  To investigate the effects and possible mechanisms of genistein (GEN), a kind of phytoestrogens, combined with cisplatin (DDP) on human ovarian cancer cells in nude mice. METHODS:  Ovarian cancer cell line HO8910PM derived from human ovarian serous adenocarcinoma was transplanted into 20 nude mice, which were then randomized equally into 4 groups: GEN treatment group, DDP treatment group, DDP plus GEN treatment group, and a control group. Four weeks later, the body mass of the nude mice was recorded and the morphology of tumor cells was observed by microscope. The expressions of PCNA and microvascular density (MVD) were examined by immunohistochemistry. RESULTS:  GEN and DDP effectively inhibited the growth of human ovarian cancer cells transplanted into nude mice and the inhibitory effect was enhanced with combination of GEN and DDP. The expressions of PI and MVD in GEN plus DDP group were lower than those in GEN group or DDP group, which however were lower than those in control group (P<0.01). The morphological changes in condensation and margination of nuclear chromatin, apoptotic bodies and cell necrosis significantly increased in GEN group and GEN plus DDP group. CONCLUSION:  Both DDP and GEN can inhibit the growth of transplanted human ovarian cancer cells in nude mice and exert synergistic antitumor effect. The anticancer mechanism of GEN may involve suppressing the proliferation of ovarian cancer cells and angiogenesis and blocking the blood supply of the tumor.

　　【Keywords】 ovarian neoplasms;  genistein;  cisplatin;  neovascularization, pathologic; proliferating cell nuclear antigen

　　【摘要】目的： 观察植物雌激素染料木黄酮（GEN）与顺铂（DDP）联合应用人卵巢癌裸鼠移植瘤的效应及其机制. 方法：  建立20只人卵巢癌裸鼠移植瘤模型，随机分成4组，分别为对照组、GEN组、DDP组及GEN+DDP组. 4 wk后处死裸鼠，抑瘤率，用Ⅷ因子抗原多克隆抗体测定肿瘤内微血管密度（MVD），用细胞增殖指数（PI）反映细胞增殖状态，并进行形态学观察. 结果: DDP组及GEN组均可有效抑制卵巢癌移植瘤生长，二者联合应用有协同作用. GEN+DDP组MVD和PI低于GEN组和DDP组(P<0.01)，3组均显著低于对照组(P<0.01). 形态学观察可见GEN组和GEN+DDP组细胞凋亡、凋亡小体及变性坏死增多，而对照组少见. 结论：  GEN对人卵巢癌HO8910PM细胞裸鼠移植瘤有明显抑制作用，且与DDP有协同作用；GEN对肿瘤细胞的作用，与抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤区新生血管的生长、阻断肿瘤血供有关.
 
　　【关键词】 卵巢肿瘤；染料木黄酮；顺铂；新生血管化，病理性；增殖细胞核抗原

　　0引言

　　卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，其死亡率居妇科恶性肿瘤之首. 重金属化疗药顺铂（cisplatin, DDP）是治疗卵巢癌最有效的药物之一，但因其毒副作用明显，很多患者不能耐受，使其应用受限. 染料木黄酮（genistein, GEN）是植物雌激素的一种，体内外研究表明GEN对乳腺癌、前列腺癌和结肠癌细胞有明显抑制作用［1-3］. 目前关于GEN对卵巢癌的体内研究甚少. 本研究以HO8910PM细胞株构建人卵巢癌裸鼠移植瘤模型，观察GEN及其与DDP的联合应用对卵巢癌的作用，并对其机制进行评价，为GEN的开发和提高卵巢癌临床治疗疗效提供新的思路.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人卵巢癌细胞株HO8910PM由第四军医大学妇产科实验室提供；Balb/c遗传背景的先天性细胞免疫缺陷动物，nu/nu裸小鼠，雌性，鼠龄4～6 wk，体质量18～21 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［许可证号：SCXK(沪)20030003］，饲养于第四军医大学实验动物中心SPF级环境［许可证号：SYXK(军)2002023］. DDP为山东齐鲁制药厂生产，生产批号0412149；GEN为第四军医大学药物研究所产品，批号: 20041225；兔抗人Ⅷ因子相关抗原（factor Ⅷ related antigen）多克隆抗体、小鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒，购自北京中杉金桥生物公司.
 
　　1.2方法

　　1.2.1动物模型的建立卵巢癌细胞株HO8910PM，常规方法复苏，接种于含150 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃， 50 mL/L CO2饱和湿度培养箱内，大量扩增细胞. 将处于对数生长期的细胞制成 2×107/mL悬液，注入裸鼠后背部皮下. 穿刺点距注射部位1.2 cm，每只裸鼠皮下接种1点，每点 0.2 mL，含4×106个细胞.

　　1.2.2治疗待移植瘤直径长成4 mm左右时（约接种后7 d），采用随机数字法将20只裸鼠随机分成4组，每组5只. GEN组灌胃给予GEN 50 mg/kg・d，共30 d；DDP组腹腔注射DDP 5mg/kg・d，实验开始连续用1 wk后停药；GEN+DDP组给予GEN及DDP，给药方法及途径同上；对照组每日灌胃给予去离子水. 每只裸鼠灌胃或腹腔注射剂量为0.2 mL/次.

　　1.2.3观察指标GEN治疗30 d后，脱颈处死各组裸鼠，称体质量，解剖裸鼠. 取移植瘤称质量，计算各组平均瘤质量及抑瘤率（IR），IR＝（1-治疗组平均瘤质量/对照组平均瘤质量）×100％. 按金正均法计算q值来评价GEN与DDP两药合用的效果，q=(EA+B)/［EA+(1-EA)×EB］, EA+B为两药合用时的抑瘤率，EA 和EB为各药单独应用时的抑瘤率. q＜0.85表示两药有拮抗作用，0.85≤q≤1.15表示两药有相加作用，q＞1.15 表示两药有协同作用. 各组裸鼠心、肝、脾、肺、肾等重要脏器及移植瘤，用40 g/L中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片. HE染色，光镜下观察. SP免疫组化按试剂盒说明进行操作，Ⅷ因子相关抗原抗体或PCNA抗体的工作浓度均为1∶100. Ⅷ因子只在血管内皮细胞表达，任何一个胞质呈棕染色的内皮细胞或内皮细胞簇，与周围其他组织有明显界限，无论有无管腔，定义为一个血管. 在低倍镜（100倍）下选定移植瘤内血管密度最高的5个区域，再在高倍镜(200倍)下计数每个视野的血管条数，以平均值为该移植瘤的微血管密度（microvessel density, MVD）［4］. PCNA定位于细胞核上，阳性染色为棕黄色. 先在低倍镜（100倍）下选择染色阳性的高密度区域，再换高倍镜(200倍)观察，至少计数500个肿瘤细胞，其中阳性细胞所占百分比即为PCNA标记指数(PCNA labelling　index, PI).
 
　　统计学处理：实验数据以x±s表示，各组经方差齐性检验后，采用单因素方差分析以及两两比较的LSD法. P<0.05为有统计学差异.

　　2结果

　　2.1GEN对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响GEN组在用药15d后移植瘤生长速度开始放缓，裸鼠正常进食并且体质量增加. 实验结束时，GEN组移植瘤平均瘤质量（1.04±0.04）g ，低于对照组（1.68±0.03）g （P<0.01），DDP组移植瘤平均瘤质量（0.87±0.02 g）也低于对照组（P<0.01）. GEN+DDP组移植瘤生长抑制最明显，实验期内移植瘤生长缓慢，实验结束时，移植瘤平均瘤质量明显降低（0.35±0.01） g （P<0.01），也低于DDP组和GEN组（P<0.01）. GEN组、DDP组和GEN+DDP组抑瘤率分别为37.98%, 48.10%和79.40%，按金正均法计算q值为1.17.

 
　　2.2裸鼠体质量的变化实验开始各组裸鼠体质量差异无显著性. 实验结束时，DDP组体质量（18.99±0.72）g均低于GEN组（22.06±0.28）g和GEN+DDP组（22.23±0.59）g （P<0.01和P<0.01）；并且实验结束时DDP组体质量也明显降低（20.25±0.99）g （P<0.01）. 与对照组体质量（18.84±0.63）g比较，GEN组体质量和GEN+DDP组体质量明显增加（P<0.01）.
 
　　2.3移植瘤内MVD和PI值GEN组，DDP组和GEN+DDP组移植瘤内MVD值和PI值较对照组明显降低，差异均有显著性（P<0.05，表1，图1AD）.表1人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤组织MVD和PI值(略)

　　2.4裸鼠重要脏器及移植瘤HE染色裸鼠重要脏器组织在光镜下观察未见明显异常，各组无明显差别. 对照组肿瘤细胞排列成团块状，细胞核大、浓染、不规则，核质比例大，异染色质成块状，边极分布，核仁明显，肿瘤细胞有少量坏死，可见较多核分裂象. GEN组肿瘤细胞排列成团块状，肿瘤细胞部分区域坏死明显，细胞核染色质浓缩，核仁不明显，并可见凋亡细胞，核分裂象较少. DDP组肿瘤细胞可见坏死细胞较多. GEN+DDP组肿瘤细胞排列紊乱，出现大片区域坏死，肿瘤细胞中有大量淋巴细胞浸润，肿瘤细胞体积变小，可见凋亡小体，细胞质密度增大，细胞核染色质浓缩、碎裂成片状，核分裂象少见.

　　3讨论

　　染料木黄酮广泛存在于植物中，为杂环多酚化合物，结构为非类固醇类化合物，与17β雌二醇、己烯雌酚及三苯氧胺相似［5］. 近年来大量体内外研究表明GEN对乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞有抑制作用，其机制可能为染料木黄酮增加DNA－拓扑异构酶复合物的稳定性，进而抑制拓扑异构酶的活性，导致双链DNA断裂，从而引起肿瘤细胞生长抑制或死亡［6］. 但目前关于GEN对卵巢癌作用的体内研究相对较少. 本实验通过构建人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型进行研究，结果显示GEN组抑瘤率可达37.98%，表明人卵巢癌移植瘤的生长受到明显抑制. 成功阻断肿瘤新生血管的形成，是抑制肿瘤的生长和转移的关键［7］. 本实验通过构建皮下移植瘤模型，应用GEN干预治疗，发现GEN组和GEN+DDP组肿瘤微血管数量减少，MVD值均显著低于对照组，HE染色结果显示GEN治疗后移植瘤组织内部分区域坏死明显，提示GEN可通过抑制肿瘤血管生成导致肿瘤细胞坏死，发挥抗肿瘤作用.

　　PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子，是DNA合成不可缺少的因子，也是一种细胞周期调节蛋白. 许多研究证实，在生长快速的肿瘤组织中，增殖细胞均呈PCNA阳性反应，因PCNA存在于增殖活跃的细胞核内，故PCNA的表达可作为估计肿瘤细胞增殖活性的指标［8］. 本实验过程中发现GEN组和GEN+DDP组移植瘤生长缓慢，GEN+DDP组尤为明显. GEN治疗30 d后GEN组和GEN+DDP组移植瘤质量显著小于对照组. 通过对移植瘤组织进行免疫组织化学方法检测，发现GEN组和GEN+DDP组人卵巢癌细胞增殖核抗原表达下降，GEN组和GEN+DDP组PI值均显著低于对照组. 结果说明GEN还可通过抑制肿瘤细胞增殖，使肿瘤生长缓慢，表现其肿瘤抑制作用.

　　本实验中还选用阳性对照药物DDP，来观察GEN作用效能及药物协同作用. DDP为妇科肿瘤治疗中常用的化疗药物，尤其对卵巢癌有效［9］，但由于DDP只能静脉或腹腔注射而不能口服给药，加之胃肠道反应明显，骨髓抑制，肾脏、神经毒性等毒副作用严重，使其临床应用受限［10］. 本实验采用DDP腹腔注射途径给药，实验结束时DDP组瘤质量明显低于对照组，但体质量显著低于实验开始时体质量. 实验结果说明DDP可抑制卵巢癌裸鼠移植瘤生长，但其毒副作用仍不容忽视. 本实验发现GEN+DDP组移植瘤生长缓慢，在各组裸鼠中GEN+DDP组抑瘤率最高. 各组抑瘤率按金正均法 q值大于1.15，表明GEN和DDP有协同作用. 更重要的是，GEN组和GEN+DDP组裸鼠体质量较对照组明显增加. GEN增加体质量的作用，在临床上可以缓解化学治疗所致的厌食、体质量减轻等症状，在细胞毒性化学治疗中辅以GEN，可以增强癌症患者对细胞毒性化学治疗的耐受性. 但GEN组和GEN+DDP组并没有出现肿瘤消退现象，这可能与卵巢癌发病是多因素的有关.

　　我们的研究提示GEN无明显毒副作用，可有效抑制卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的生长，其机制与抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成相关，并且与DDP有协同效应.

　　【】

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