鞘内注射地西泮抑制大鼠直肠注入甲醛诱发的内脏痛
【关键词】 内脏痛觉
Suppressive effect of intrathecal administration of diazepam on visceral pain induced by rectal instillation of formalin in rats
【Abstract】 AIM: To explore whether diazepam has a suppressive effect on visceral pain at the spinal level. METHODS: By intrathecal drug administration, the effect of diazepam on persistent visceral pain induced by rectal instillation of formalin was studied. RESULTS: Rectal instillation of formalin induced obvious visceral pain responses, which occurred mainly within 0~75 min after the rectal administration of formalin. Intrathecal pretreatment with three doses of diazepam suppressed the visceral pain responses induced by formalin and the analgesic action of diazepam was mainly within 0~60 min after the rectal administration of formalin. CONCLUSION: Intrathecal pretreatment with diazepam suppresses the visceral pain induced by rectal instillation of formalin, which suggests that diazepam exerts some suppressive effect on visceral pain at the spinal level.
【Keywords】 diazepam; visceral pain; formaldehyde; latency
【摘要】 目的： 研究地西泮在脊髓水平对内脏痛有无抑制作用. 方法： 采用鞘内给药的方法观察地西泮对大鼠直肠注入甲醛致持续性内脏痛的抑制作用. 结果： ① 直肠注入甲醛可引起大鼠剧烈的内脏痛反应，疼痛反应主要集中在甲醛刺激大鼠直肠后的75 min内. ② 鞘内预先注入三个剂量的地西泮均可抑制甲醛刺激大鼠直肠诱发的内脏痛，镇痛作用主要集中在甲醛刺激直肠后的0~60 min. 结论： 鞘内注射地西泮可抑制大鼠直肠注入甲醛引起的内脏痛觉，提示地西泮在脊髓水平对内脏痛有抑制作用.
【关键词】 地西泮；内脏痛觉；甲醛；潜伏期
0引言
地西泮（diazepam, valium, 安定）是苯二氮革类的典型代表药物，也是临床上最常用的镇静、催眠及抗焦虑药.以往研究表明，鞘内注入地西泮可抑制躯体痛觉的传入［1］. 但其是否可以作用于脊髓从而抑制内脏痛觉的传入尚无定论.故本实验利用甲醛内脏痛模型，应用鞘内注射地西泮至腰骶膨大的方法探索地西泮在脊髓水平对内脏痛是否有抑制作用.
1材料和方法
1.1材料
雄性Sprague Dawley (SD)大鼠48只，体质量180~220 g（第四军医大学动物实验中心提供），实验前3 d将大鼠置于20~24℃，湿度为50%~60%的环境，保持昼夜节律. 实验时，将大鼠随机分为6组（每组8只）： 直肠对照组： 直肠注入0.5 mL生理盐水；模型组： 直肠注入0.5 mL 20 g/L甲醛；鞘内对照组： 鞘内注入10 μL生理盐水，10 min后直肠注入0.5 mL 20 g/L甲醛；低剂量实验组：鞘内注入10 μL浓度为0.4 g/L的地西泮，10 min后直肠注入0.5 mL 20 g/L甲醛；中剂量实验组： 鞘内注入地西泮的浓度为1.6 g/L，其余同低剂量实验组；高剂量实验组：鞘内注入地西泮浓度为3.0 g/L，其余同低剂量实验组. 地西泮（针剂）购于西安利君制药股份有限公司.实验过程中，保持温度（20~24℃）、湿度（50%~60%）和周围环境安静，避免不必要刺激的影响.本实验操作严格遵守国际疼痛学会(IASP)制定的《关于使用清醒动物进行疼痛研究的纲要》.
1.2方法
1.2.1鞘内置管术经腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）深度麻醉大鼠后，从C7水平沿背正中线向尾部切开皮肤、皮下组织、肌肉，暴露并去除T4椎板（约1 mm×1 mm），切开硬脊膜，经鞘内向尾部置入内腔充盈7 μL生理盐水的聚乙烯PE8导管（内径0.28 mm，外径0.6 mm，购自日本Natume公司），根据动物大小确定置入导管从入口到腰骶膨大处的长度（大约3～5 cm），经导管注入生理盐水后见硬膜破口处有脑脊液流出证明导管在蛛网膜腔内. 封外口，局部青霉素抗感染.术后单笼饲养3～5 d，观察动物状态良好，无活动障碍，则可进行实验［2］.
1.2.2鞘内给药鞘内置管术未引起大鼠运动障碍和毒性反应. 鞘内对照组和三个实验组的大鼠在实验玻璃箱适应30 min后，乙醚麻醉，用10 μL微量注射器（宁波镇海玻璃仪器厂）将10 μL生理盐水或不同浓度地西泮以0.5 μL/s的速度注入预先置好的聚乙烯PE8导管，后用7 μL生理盐水洗脱，确保地西泮注入到脊髓，封外口. 动物实验完毕后，解剖证实导管内口开口于蛛网膜下腔腰骶膨大处. 局部脊髓无损伤及陈旧性出血，说明本实验结果可靠.
1.2.3内脏疼痛的行为学观察将30 cm×30 cm×30 cm的透明有机玻璃箱置于高于实验台45 cm的玻璃台上，实验前30 min将大鼠置于其中使其适应环境，后用乙醚将其麻醉，在肛门周围裸露皮肤涂抹凡士林（避免甲醛接触肛周皮肤引起躯体痛觉），将直径1.5 mm的圆头细管迅速经肛门插入直肠（鞘内对照组和实验组鞘内生理盐水或地西泮处理10 min后进行此操作），按分组要求分别将0.5 mL生理盐水或0.5 mL 20 g/L甲醛溶液注入大鼠直肠. 以5 min为间隔，观察并记录90 min内大鼠的内脏痛相关行为（viseral pain related behaviors, VPRB）的数目［3］［A： 大鼠舔或轻咬腹部、下肢及会阴周围的皮肤；B： 伸展躯体使其拉长；C： 腹部收缩侧屈身体；D： 全身收缩使背部拱起呈弓形，持续时间 (t)<30 s；E： 全身收缩使背部拱起呈弓形，30 s
统计学处理： 用SPSS 11.0软件进行统计学处理. 数据以x±s表示，用重复测量数据的方差分析对不同组的内脏疼痛反应做统计学分析，用Dunnettt法分析第一个内脏痛相关行为的潜伏期. P＜0.05为差异有显著性.
2结果
2.1直肠注入甲醛后诱导的疼痛反应以15 min为间隔，统计大鼠直肠注入不同溶液后90 min内的行为学指标(见表1). 大鼠直肠注入甲醛，可引起了大鼠剧烈的内脏痛觉，疼痛反应主要集中在甲醛刺激直肠后的75 min内，其中，在甲醛刺激直肠后15~30 min，疼痛反应最剧烈.
2.2鞘内给予地西泮抑制大鼠内脏痛觉反应鞘内注射生理盐水对内脏痛觉影响较小(表1). 3个实验组与模型组比较，内脏疼痛反应均明显减弱(P<0.001). 鞘内应用三个浓度地西泮发现：鞘内注射地西泮的镇痛作用主要集中在甲醛刺激直肠后的0~60 min，鞘内地西泮浓度为3.0 g/L时，地西泮的镇痛作用的持续时间最长，为60 min，而低浓度的地西泮（0.4 g/L, 1.6 g/L）的镇痛作用持续45 min.
2.3各组大鼠出现第一个VPRB的潜伏期直肠对照组、模型组、鞘内对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组第一个VPRB的潜伏期分别为(79.2±11.8) s; (22.5±1.4 ) s; (24.1±1.7) s; (47.3±5.3) s; (42.3±3.5) s; (69.2±7.2 ) s. 模型组第一个VPRB的潜伏期较直肠对照组明显缩短（P<0.05），但模型组和鞘内对照组第一个VPRB的潜伏期无显著差异(图1). 实验组与模型组比较，实验组第一个VPRB的潜伏期较模型组明显增加(P＜0.05).表1各组大鼠直肠注入生理盐水或甲醛后内脏疼痛反应(略)
3讨论
内脏痛（visceral pain）是一种临床上常见的疼痛现象.目前研究内脏痛的模型较多，但在实验过程中易混杂躯体痛觉的影响. 在本研究中，我们直接将0.5 mL浓度为20 g/L的甲醛溶液通过圆头塑料管注入大鼠直肠，观察并计数内脏痛相关行为发现，直接将甲醛注入直肠后大鼠的内脏痛行为反应较直肠对照组强烈，并且大鼠出现第一个VPRB的潜伏期较直肠对照组也明显缩短，表明直接将甲醛注入大鼠直肠可诱发大鼠的内脏痛觉，并且甲醛诱发的内脏痛觉呈单相，主要集中在甲醛刺激直肠后的75 min内，这不同于将甲醛注入直肠壁致内脏痛所呈现的双相时程［3］. 另外，本研究在直肠注入甲醛之前，将凡士林涂抹在大鼠的肛门周围，避免了躯体痛觉的影响，因此，本研究中甲醛刺激大鼠直肠引起的内脏痛有特异性.
另外，将三种不同剂量的地西泮注入大鼠的蛛网膜下腔，发现鞘内注入地西泮对大鼠的内脏痛觉有抑制作用，主要表现在两个方面： ① 直肠注入甲醛后的75 min内，实验组大鼠的内脏痛反应较模型组明显减弱；② 鞘内注入地西泮后，大鼠出现第一个VPRB的潜伏期较模型组明显延长. 另外，地西泮对内脏痛抑制作用的持续时间与地西泮剂量成依赖关系，即鞘内注入的地西泮剂量越大，其对内脏痛的抑制时间越长.
鞘内地西泮对内脏痛的抑制作用可能与中枢神经系统中的GABA有关.以往的很多证据表明，GABA及其受体在疼痛的调节过程中发挥重要的作用［4］. 另外，骶髓后连合核（sacral dorsal commissualnucleus, SDCN）是位于腰骶膨大处的重要核团［5］，是盆腔内脏伤害性信息感觉传递的中继站［6］，其内分布大量的GABA免疫阳性的神经元、终末以及GABAA受体［5,7-8］. 地西泮作为GABAA受体的配体之一，可作用于GABAA受体，促进GABA与GABAA受体的结合，通过增强Cl-通道开放的频率增强GABA对GABAA受体的作用而显示中枢抑制作用. 在本实验中，鞘内注射地西泮至腰骶膨大，地西泮可能作用于SDCN上的GABAA受体，促进GABA与GABAA受体的结合能力，增强了GABAA受体上Cl-通道开放的频率，进一步抑制了内脏痛觉传入神经元间的突触活动，使内脏痛觉传入过程受阻，因此，鞘内地西泮预处理10 min后将甲醛注入直肠，大鼠的内脏疼痛反应以及出现第一个VPRB的潜伏期较模型组分别减少和延长. 但至于地西泮是否真正可以增强GABA与SDCN上GABAA受体的结合，并无确切报道，有待于进一步探究.
【】
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