弥漫性大B细胞淋巴瘤bcl

                                            作者：蒋会勇，陈愉，张三泉，朱梅刚，赵彤        

【关键词】  弥漫

    Correlation between bcl2/IgH gene rearrangement and GCB molecular subtype in diffuse large Bcell lymphoma

      【Abstract】 AIM: To explore the correlation between bcl2/IgH gene rearrangement and germinal center Bcelllike (GCB) molecular subtype in diffuse large Bcell lymphoma (DLBCL). METHODS:  Selfdesigned heminested PCR was used to detect bcl2/IgH gene rearrangement in 60 cases of DLBCL. Positive PCR products were cloned and sequenced. The tissue microarray of 60 specimens of DLBCL was prepared and the expressions of CD20, CD10, Bcl6 and MUM1 were investigated by immunohistochemical SP method. GCB and nongerminal center Bcelllike (nonGCB) were subclassified. RESULTS:  Six of the 60 DLBCL were bcl2/IgH positive by conventional PCR method. Selfdesigned heminested PCR was used to amplify 6 positive cases again and  bcl2/IgH gene was verified rearrangement in 5 cases by cloning and sequencing and 1 had the gene segment of BAC331191 of human chromosome 19. CD20 was positive in the 60 DLBCL cases. Positive expression rates of CD10, Bcl6 and MUM1 were 43.3%, 46.7% and 61.7% respectively. 32 (53.3%) were GCB and 28 (46.7%) were nonGCB. Bcl2/IgH gene rearrangementpositive cases were all GCB subtypes, which were significantly correlated with the expression of CD10 (P=0.012) and not with Bcl6 and MUM1. CONCLUSION:  Selfdesigned heminested PCR can improve the detection accuracy of bcl2/IgH gene rearrangement. Bcl2/IgH gene rearrangement detection helps the DLBCL determination of GCB subtypes.

    【Keywords】 lymphoma, Bcell, diffuse large；bcl2; gene rearrangement

    【摘要】 目的: 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）bcl2/IgH基因重排与分子亚型生发中心样（GCB）的相关性. 方法:采用自行设计的半巢式PCR对60例DLBCL的bcl2/IgH基因重排进行了检测，并对阳性产物进行克隆、测序.  同时采用免疫组化SP法在组织微阵列上同步观测CD20，CD10，Bcl6，黑色素瘤相关抗原（突变体）1 (MUM1)的表达,进行GCB和非生发中心样(nonGCB)分子分类. 结果: 经常规法扩增bcl2/IgH，有6/60例DLBCL bcl2/IgH阳性；在6例阳性样本中,采用本组设计的半巢式PCR扩增，经克隆及测序证实5例bcl2/IgH基因重排阳性，1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段. 60例DLBCL CD20表达全部阳性；CD10，Bcl6， MUM1的阳性表达率分别为43.3%，46.7%，61.7%；GCB 32（53.3%）例，nonGCB 28（46.7%）例. bcl2/IgH基因重排阳性的病例均属GCB分子亚型, 且与CD10表达有显著性相关（P=0.012），而与Bcl6及MUM1表达无相关性. 结论:使用本组设计的半巢式PCR可提高bcl2/IgH基因重排检测的准确性. bcl2/IgH基因重排的检测可协助确定部分GCB分子亚型的DLBCL.

    【关键词】 弥漫性大B细胞淋巴瘤； bcl2; 基因重排

    0引言

    弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large Bcell lymphoma, DLBCL）是最常见、高度恶性的非霍奇金淋巴瘤，但新近cDNA芯片的研究结果显示，该瘤存在生发中心样（germinal center Bcelllike，GCB）和非生发中心样（non germinal center Bcelllike, nonGCB）两种分子亚型，GCB的预后明显好于nonGCB类型［1-2］. Hans等［3］以cDNA芯片为参照标准，发现利用“套餐”式免疫标记物CD10，Bcl6，黑色素瘤相关抗原（突变体）1 ［melanoma associated antigen(mutated)1, MUM1］也可以对DLBCL进行分子分类. bcl2/IgH基因重排是人类恶性淋巴瘤最常见的染色体异常，存在bcl2基因重排的病例有较好的生存率. 我们利用组织微阵列(tissue microarray, TMA)技术对60例DLBCL进行分子分类, 采用PCR技术检测bcl2/IgH基因重排，探究bcl2/IgH基因重排与分子亚型的相关性，旨在为临床判断DLBCL的预后提供更多的信息.

    1材料和方法

    1．1材料1999/2003年诊断明确资料齐全的DLBCL 60（男29，女31）例，中位年龄53.3（16~91）岁，所有标本均为40 g/L中性甲醛固定, 常规石蜡切片HE染色. 由3名专门从事淋巴瘤研究的医师按新的WHO分类方法进行诊断. SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司; CD20购于福州Maxim公司；CD10购于美国Zymed公司；Bcl6购于美国Neomarker公司； MUM1 mAb由意大利Perugia大学血液病研究所Dr. Falini馈赠.

    1．2方法

    1．2.1bcl2/IgH基因重排的检测DNA提取采用我室建立的石蜡切片刮片法，每例切片1张，厚3 μm，常规脱蜡、干燥. 用无菌刀片刮入Eppendorf管，加入50 μL消化液(10 mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA, 200 mL/L Tween 20)，同时加入蛋白酶K（终浓度为200 mg/L），56℃水浴孵育过夜，充分消化后，98℃, 10 min灭活蛋白酶K，12 000 g离心10 min，分装上清液，用分光光度计检测DNA的浓度，将浓度调整至200～400 μg/L，-20℃保存备用.

    1．2．2半巢式PCR检测bcl2/IgH基因重排bcl2/IgH 基因重排的检测采用半巢式PCR. 第一次扩增PCR引物为：上游:MBR 5′TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTG3′; 下游JH1: 5′ACCTGAGGAGACGGTGACC3′. 该对引物为检测bcl2/IgH 基因重排常用引物［4］. 利用专业的引物设计软件Primer premier, 我们在MBR下游设计了第二重引物: Mbr1 5′CAACACAGACCCACCCAGAG3′与原下游引物JH1构成半巢式PCR反应的第二对引物. 反应体系为:10×PCR 缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2 1.5 μL, 10 mmol/L dNTP 0.4 μL,上下游引物各0.8 μL,Taq DNA聚合酶0.2 μL，模板1 μL(浓度200~500 mg/L),三蒸水13.3 μL,总反应体系为20 μL. 半巢式PCR的反应体系为10×PCR缓冲液2 μL, 25 mmol/L MgCl2 1.2 μL, 10 mmol/L dNTP 0.4 μL,上下游引物各1 μL, Taq DNA聚合酶0.25 μL，模板1 μL,三蒸水13.15 μL.反应条件为95℃变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共35个循环，然后，72℃终末延伸10 min，4℃保存30 min. 半巢式PCR模板为一步法的产物稀释100倍. 产物以20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭（EB）1.5 μL染色. 所有PCR操作过程中严格按PCR操作规程进行. 阳性对照采用经测序证实为基因重排阳性的DNA，阴性对照为双蒸水. PCR阳性产物经TA克隆连于T载体，送上海博亚公司进行测序. 测序采用3730测序仪，DNA测序技术主要依据Sanger双脱氧链终止法. 测序结果在基因库中进行比对，以明确是否为 bcl2/IgH 基因重排片段.

    1.2.3TMA制作首先对60例DLBCL蜡块组织的苏木精-伊红染色切片作形态学观察，选择有代表性的肿瘤区域，在相应位置进行标记；然后使用组织微阵列仪（Beecher Instruments, MTA1）制作受体蜡块并打孔，根据原有切片的标记部位，用供体针在蜡块相应部位取样，所用组织芯直径为0.6 mm，将供体组织芯放入受体蜡块. 每例标本在标记区域内随机取2~4条组织芯. 在组织样本填入蜡孔时记录每个样本在二维阵列中的具体位置，并在一定位置上标记出TMA的方位.

    1.2.4免疫组化染色采用SP法进行免疫组化染色. 以CD20染色来判断每个组织点的肿瘤细胞数，每例标本以肿瘤细胞数最多的点作分析. 抗体的阳性判断标准为：CD20，CD10阳性定位于细胞膜，Bcl6，MUM1阳性定位于细胞核, >20%的肿瘤细胞染色判为阳性［3］. 采用CD10， Bcl6和MUM1 3种抗体对DLBCL进行分类［3］. CD10， Bcl6作为生发中心细胞的标志物，CD10+或CD10+/Bcl6+为GCB类；CD10-/Bcl6-为nonGCB类；MUM1作为后生发中心细胞来源的标志物，若CD10-/Bcl6+，则用MUM1来分类：MUM1+为nonGCB类，MUM1-为GCB类.
统计学处理: 使用SPSS 9.0软件,对数据进行Fisher精确检验.

    2结果

    2．1组织学分型根据WHO新分类方法对DLBCL进行分型，中心母细胞型(centroblastic，CB) 53例(88.3%)，免疫母细胞型（immunoblastic，IB）3例(5.0%)，间变性大B细胞型（anaplastic，AP) 2例(3.3%)，未分型2例(3.3%).

    2．2蛋白表达60例DLBCL患者的组织切片CD20表达全部阳性.  CD10， Bcl6， MUM1的阳性表达率分别为43.3%， 46.7%， 61.7%， 其中CD10+  Bcl6+ 14例， CD10+/MUM1+ 13例，Bcl6+/MUM1+ 16例，CD10+/Bcl6+/MUM1+ 8例（图1）. 经统计学分析，年龄性别等因素与CD20, CD10, Bcl6表达无关（表1）.

    2．3DLBCL TMA分子分类60例DLBCL中， 32例（53.3%）GCB，28例（46.7%）nonGCB. 在32例GCB类中， 26例（81.3%）CD10+，18例（56.3%）Bcl6+，14例（43.8%） CD10+/Bcl6+， 6例(18.8%) CD10-/Bcl6+. 在28例nonGCB类中，24例（85.7%）MUM1+，8例（28.6%） MUM1+/Bcl6+.A：细胞膜CD20+ ×100;  B：细胞核Bcl6+ ×100;  C: 细胞膜CD10+ ×200; D: 细胞核MUM1+ ×100.

    图1弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫组化染色SP

    2．4基因重排检测因bcl2/IgH基因断裂在不同病例略有差异，所以扩增出的片段为100～300 bp(图2). 经一步法扩增，发现6例阳性，对阳性样本进行半巢式PCR扩增时发现5例基因重排阳性，考虑一步法扩增有假阳性，经克隆及测序证实为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段，其序列为: TTAGAGAGTTGCTTTACGTGGCCTGCCTCTCTCACCT
CCCAGGTGAACGGTGTGGACATGAAGCTGCCCGTGG
TGCTGGCCAACGGCCAGATCCGTGCCTCCCAGCATG
GTTCAGATGTTGTGATTGAGACCGACTTCGGCCTGCG
TGTGGCCTACGACCTTGTGTACTATGTGCGGGTCACC
GTCTCCTCAGGT, 因此bcl2/IgH基因重排为5例. 基因重排阳性的5例病例均为GCB亚类.  CD10阳性及阴性病例bcl2/IgH基因重排的发生率分别为19.23%(5/26)及0%(0/34)，有统计学差异（P=0.012）(表1).

    表1弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫组化与临床资料及bcl2/IgH基因重排关系(略)

    图2PCR检测bcl2/IgH重排

    3讨论

    本组60例DLBCL，CD10的阳性率高于西方Hans等［3］的28%和Colomo等［4］的21%, 可能与本组选用的病例多为CB变型的B细胞淋巴瘤有关.  CD10诊断GCB的敏感性较低，经CD10和Bcl6联合应用，在GCB类中发现了6例CD10阴性、Bcl6阳性，说明联合应用CD10及Bcl6可提高GCB亚类的检出率. 本组检测MUM1阳性率与报道（50%~77%）相近［5-6］. 我们使用传统引物进行bcl2/IgH基因重排检测发现的阳性样本，采用本组设计的半巢式PCR扩增及克隆、测序证明有1例为人类第19号染色体BAC 331191基因的片段，该片段的上下游分别有9个碱基能与传统引物互补配对，因此进行PCR时可能将其扩增出来，而非真正的基因重排. 这可能是传统引物检测重排发生假阳性的分子生物学基础. 结果显示采用我们所设计的半巢式PCR引物检测bcl2/IgH基因重排可有效的避免假阳性的发生. 在我们的研究中，所有存在bcl2基因重排的病例均表达CD10，统计学资料表明二者存在相关性，因此通过对bcl2基因重排的检测可确定部分GCB类的DLBCL. 这部分DLBCL与其它类型的DLBCL相比可能有不同的发病机制，属不同的疾病亚型［7-8］. 正确的检测方法对这种疾病的正确诊断有着重要意义，我们使用的半巢式PCR提高了诊断重排的准确性.本研究在进行免疫组化过程中，我们采用了TMA技术，由于所有标本均在一张切片上进行免疫组化染色，人为误差少，一致性更强，有助于在同一水平进行观察分析和比较研究，因此本研究的免疫组织化学染色结果是可靠的.

    【文献】

［1］ Rosenwald A, Wright G, Chan WC, et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse largeBcell lymphoma［J］. N Engl J Med, 2002,346(25):1937-1947.
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