无泵驱动体外膜肺治疗犬急性呼吸衰竭时的内皮素
【关键词】 呼吸功能不全；,,,内皮素
Dynamic change of endothelins1 in plasma and lung tissue of dogs with acute respiratory failure treated with pumpless extracorporeal membrane oxygenation
【Abstract】 AIM: To study the dynamic change of the endothelins1 (ET1) in plasma and lung tissue of dogs with acute respiratory failure (ARF) treated by bilateral femoral arteriovenous extracorporeal membrane oxygenation （bAVECMO）. METHODS: A total of 10 ARF dog models were treated by the bAVECMO. Right atrium blood and lung tissue were collected at different time (before experiment, when models were established, 1, 2, 3, 4 h during ECMO). ET1 was detected dynamically by radioimmunological and immunohistochemical methods during bAVECMO. RESULTS: ET1 content in plasma was descendent from the original level （the moment when the models were completed）， went back at 1 h and peaked at 2 h, then it descended. ET1 content in lung homogenate get to the peak at 2 h and then started to decrease. The statistical analysis showed ET1 contents in plasma or lung tissue changed significantly between pre and postECMO. CONCLUSION: The bAVECMO has a positive significance in the early treatment of ARF.
【Keywords】 respiratory insufficiency； endothelins1；bilateral femoral arteriovenous extracorporeal membrane oxygenation
【摘要】 目的: 观察双侧股动脉股静脉无泵驱动体外膜肺（bAVECMO）急性呼吸衰竭犬,血浆及肺组织内皮素1（ET1）的表达变化. 方法: 10只犬在建立急性呼吸衰竭模型情况下给予bAVECMO治疗. 分别于实验开始前、模型建立完成时、转流开始后1，2，3，4 h取肺组织及血浆. 应用放免、免疫组化,观测bAVECMO期间血浆、肺组织匀浆ET1变化, 及与组织损伤的关系. 结果：犬ARDS模型血浆ET1含量在原有基础上（模型完成时）先降低，1 h后开始回升，2 h达到高值，之后缓慢下降；肺组织匀浆ET1含量转流2 h达到高值，之后缓慢下降. 统计分析表明匀浆和血浆各自ET1的均数在转流前后差异有统计学意义. 肺组织匀浆ET1转流3 h与4 h差异无统计学意义. 结论：对于急性呼吸衰竭bAVECMO的早期治疗有积极意义.
【关键词】 呼吸功能不全； 内皮素1； 双侧股动脉股静脉无泵驱动体外膜肺
0引言
在对急性呼吸衰竭(ARF)和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)的研究中，人们发现ARF，ARDS时内皮素1 mRNA表达显著增强，说明ET1参与了急性肺损伤的病理生理过程. 在对ARF，ARDS的治疗中无泵驱动体外膜肺辅助(AV)转流技术(AVECMO)由于其有效并对血液有形成分破坏轻等优点，已被应用于临床［1］. 在应用AVECMO转流中，国外均采用单侧股动脉股静脉ECMO转流，在临床中表现了一定的不足，如引流量不够大，影响了AVECMO的效果；但如应用大口径动脉插管来增加动脉引流，则会严重影响插管侧下肢血液供应等. 本项研究首次采用双侧股动脉股静脉无泵驱动体外膜肺（bAVECMO）转流技术，通过治疗犬急性呼吸衰竭模型，观察血浆、肺组织ET1的变化，为临床提供依据.
1对象和方法
1.1实验动物的准备选择健康成年家犬10只，雌雄不限，体质量为18~35（平均23.4±4.7) kg,应用35 g/L的苯巴比妥100 mg/kg进行腹腔注射行全身麻醉，待犬意识不清时，行气管插管与麻醉机连接. 常规消毒铺巾，分别解剖犬左、右两侧的股动脉及股静脉，全身肝素化静脉注射肝素，用量为1 mg/kg体质量，股动脉，股静脉上、下两端分别套丝线，结扎下端的股动脉、股静脉. 阻断股动脉、股静脉上端，在阻断与结扎血管的中下端，切开血管. 根据动、静脉内径的大小选择不同型号的PVC动、静脉插管，插管后结扎固定以防止脱出，常规缝合皮下、皮肤，防止伤口处渗血. 将动、静脉插管与bAVECMO装置连接. 右侧胸部开胸沿着第4肋间进胸，切开心包分别将心包固定在切口边缘，主动脉根部置入测压针管及测压装置，将此装置与飞利浦有创血压、心率动态监护仪连接. 当bAVECMO转流时，通过bAVECMO端口应用1000 mL/L氧气，其用量为(1.2±0.4) L/min.
1.2标本采集建立循环后，根据不同的转流时间收集标本. ①在体外循环开始前，经胸部切口取右肺下叶少许组织（10 mm×10 mm），置液氮罐待检测. ②制作呼吸衰竭动物模型进行试验. 应用潘克罗宁（Pancuronrum）（一般情况下0.1～0.2 mg/kg体质量），20 kg左右的犬首次剂量为4 mg，以后每30 min.左右追加2 mg使呼吸完全消失. 通过麻醉机调节呼吸频率和潮气量（犬在安静状态下潮气量如体重在16.4～30.5 kg，其潮气量多在251～432 mL）. 采用血气分析仪测定犬动脉血pH值、动脉血氧分压、动脉血氧饱和度及动脉血二氧化碳分压（PaCO2）值，当达到呼吸衰竭指标时，经右心房抽血10 mL于注射器内，立即密封置冰盒待检. 另经胸部切口取右肺下叶少许组织（10 mm×10 mm），置冰盒后待检测. 开始bAVECMO转流实验后1，2，3，4 h，分别经右心房抽血10 mL，胸部切口取右肺下叶少许组织（10 mm×10 mm），置液氮罐待检测.
1.3样品制备及测定方法①血浆及肺组织匀浆ET1含量测定:采用SN 695型全自动γ计数器(上海原子核所，放射免疫药盒购自解放军总科技开发中心放免所),以放射免疫法测定标本ET1含量. ②内皮素1含量的免疫组化分析，摘取肺脏用甲醛固定,制作石蜡切片,HE染色,观察肺脏光镜下病变;并用链霉菌亲生物素蛋白过氧化物酶免疫组化染色法(SP方法)进行免疫组化染色(按试剂盒说明书操作).
统计学处理：实验数据以x±s表示，血浆及肺组织ET1的组内分析采用重复测量方差分析. P<0.05有统计学意义.
2结果
2.1肺组织内皮素浓度如表所示血浆ET1含量在原有基础上（模型完成时）先降低，1 h后开始回升，2 h达到高值，之后缓慢下降；肺组织匀浆ET1含量转流2 h达到峰值，之后缓慢下降. 重复测量方差分析表明匀浆和血浆各自ET1的均数在转流前后有显著差异. 肺组织匀浆ET1转流3 h与4 h已无显著差别（表1）.表1血浆及肺组织ET1在转流期间变化（略）
2.2免疫组化结果结果评定以细胞浆或细胞膜呈现棕黄色颗粒状，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者为表达阳性（图1）.
免疫组化染色呈阳性反应（棕黄色着色）的部位：①小细支气管壁、终末细支气管壁上皮细胞及周围平滑肌细胞胞浆和胞膜；②小血管壁周围平滑肌细胞胞浆、纤维组织和结缔组织；③巨噬细胞胞浆.
与术前比较，术前部分细支气管壁上皮细胞胞浆内和胞膜可见弱阳性表达，血管壁周围和巨噬细胞中表达阴性. 造模完成后及转流期间气管壁及周围、血管壁周围明显阳性表达，少数巨噬细胞中阳性表达，其中以气管壁及周围变化最明显. 2 h之后各时间点阳性表达范围和强度未见明显变化（图1）. 与术前组织对比，造膜完成后肺组织可见散在淤血、肺泡壁间隔轻微增厚等组织轻微损伤现象，未见组织紊乱、断裂等严重组织损伤改变.
3讨论
在对于ARF，ARDS技术中，ECMO是一项具有重要意义的治疗方法. 但传统的ECMO方法有诸多缺点，如在持续使用有泵驱动转流技术ECMO治疗方面，Macdonald等［2］研究发现顽固性肺高压新生儿血中内皮素明显高于正常婴儿. 采用非ECMO治疗，患儿随着症状改善血中内皮素在3~5 d下降，而持续使用有泵驱动转流技术ECMO治疗的患儿血中内皮素却持续增高. 表明在ECMO治疗时，内皮素增加的主要原因是血泵影响的缘故. 通常国内使用人工膜肺对于呼吸疾病的治疗，往往被限制于病情危重无法控制,即患者的肺已无法完成维持生命所必须的气体交换的危重病例,这使得多数危重病例在使用ECMO治疗前其实已丧失治疗机会，我们认为这导致了ECMO应用死亡率有所夸大. Ancel等［3］研究认为，ECMO能提高儿童的生存率，但在不可逆的细胞损伤产生前应用，即早期应用是其提高生存率的关键所在. bAVECMO避免了传统ECMO治疗方法的诸多缺点,呼吸衰竭动物模型肺组织内皮素1的表达研究对其应用推广具有意义.
内皮素（ET）作为机体在缺氧、应激状态下产生的一种致损伤因子为研究者所重视. 研究认为［4］ET1是缺氧致肺血管收缩的支撑因素，单纯缺氧40 min后，血浆ET1水平有明显升高. 目前认为肺是ET1的主要生物合成和代谢场所，由203个氨基酸组成的内皮素前体原（PreproET1,PPET1）是其原始物质. 由于肺大量释放和代谢ET1，ET1释放或消耗量明显高于外周血含量，而肺循环是机体循环的重要组成部分，所以ET1的释放能够较快地从外周血中体现出来，这使得两者间ET1变化趋同. 在研究中我们对血浆和肺组织匀浆ET1测定的结果进行了分析，血浆和肺组织匀浆ET1水平自转流1 h后均呈正相关. 表明转流1 h后血浆ET1含量变化能够反映肺组织ET1含量变化. 因此在临床上可通过测定血浆内ET1含量来反映肺组织匀浆中ET1含量的变化，以便对bAVECMO治疗作出评价，对治疗方案和对bAVECMO的使用进一步改进.
实验研究发现犬急性呼吸衰竭模型肺组织匀浆、血浆ET1含量，在原有基础上（模型完成时）先降低，究其原因主要为bAVECMO转流早期由于预充液使体内液体量增加；血流重新分配致肺的血流减少. 这些原因使患者体内的总液体量增加，体重增加，组织水肿存在，血浆ET1相对减少. 而缺血、缺氧致肺部炎症组织灌注不足等情况下，肺组织生成ET1实际增多，内皮细胞和肺泡壁的损伤使ET1灭活下降，导致肺组织内ET1升高. 同时，缺氧激活多种血管活性物质，如血栓素A2，血管紧张素等，而这些物质的释放又进一步刺激内皮细胞释放ET1［5］. 所以，肺组织及血浆ET1含量在以后的研究中逐渐升高. 但由于bAVECMO的早期应用（细胞不可逆损伤产生前早期应用）减少了ET1的进一步释放，使其表达在表现出升高后减少. 免疫组化结果显示，术前部分细支气管壁上皮细胞胞浆内和胞膜可见ET1弱阳性表达，血管壁周围和巨噬细胞中表达阴性. 造模完成后及转流期间气管壁及周围、血管壁周围明显阳性表达，少数巨噬细胞中阳性表达，其中以气管壁及周围变化最为明显. 转流2 h之后各时间点阳性表达范围和强度未见明显变化，这与我们放免试验结果相一致.
在研究中，有理由认为ET1在肺脏中的表达可能随bAVECMO的转流进一步下降. 要进一步证实，须bAVECMO的长期转流试验来进行研究. 但对于急性呼吸衰竭而言，bAVECMO的早期治疗可被认为具有积极意义.
【】
［1］Liebold A, Rang CM, Philippi A, et al. Pumpless extracorporeal lung assistexperience with the first 20 cases［J］. Euro J Cardiothorac Surg,2000,17:608-613.
［2］Naoki K，Hiroshi H，Daniel IS，et al. Cardiopulmonary bypass produces greater pulmonary their systemic proinflammatory cytokinesf［J］. Anesth Analg, 2000, 90:1039-1045.
［3］Ancel JR, Alfrido T, Ralph D, et al. Extracorporeal membrane oxygenation for postcardiotomy cardiogenic shock in children［J］. Ann Thorac Surg, 1989, 47: 903-906.
［4］Takeda S, Nakanishi K, Inoue T. Delayed elevation of plasma endothelin1 during unilateral alveolar hypoxia without systemic hypoxemia in humans［J］. Acta Anaesthesiol Scand， 1997， 41(2): 274-280.
［5］Ridmord EM, Cahill PA, Podges R, et al. Regulation of endothelin recaptor sbynitricoxide in cultured ratvascular smooth musculecell［J］. J Cellular Physiol,1996,166:469-479.
