血竭提取物对人成纤维细胞增殖的影响
作者：李丹，郭树忠，王胜春，张琳西，胡永武
【关键词】 血竭；成纤维细胞；细胞增殖；伤口愈合
Effect of Dragons blood extracts on proliferation of human fibroblast cells
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of Dragons blood on the proliferation of fibroblast cells in vitro and to explore the mechanism by which Dragons blood promotes wound healing. METHODS: Human fibroblast cells were cultured in vitro in media containing gradient concentrations of 3 kinds of Dragons blood extracts (extracted by chloroform, acetidin and alcohol, respectively), which was followed by cell proliferation determination assessed with MTT assay at different time intervals. The growth curve at the most suitable concentration was drawn. The flow cytometry (FCM) was used to determine the changes of cell cycle at this concentration. RESULTS: The 0.5-2.0 g/L dilution of Dragons blood extract by acetidin enhanced the proliferation of fibroblast in a dosedependent manner. The 2.0 g/L was the optimal concentration of Dragons blood extract, and it could increase the cell ratio in Sphase of cell cycle by 18.3% of that in control group (P<0.01). CONCLUSION: Dragons blood extract by acetidin could promote the proliferation of cultured human fibroblast cells in vitro, and it might be beneficial to granulation tissue formation during wound healing.
【Keywords】 resina draconis; fibroblasts; cell proliferation; wound healing
【摘要】 目的： 观察血竭提取物对体外培养成纤维细胞增殖的影响，探讨血竭促进创面愈合的机制. 方法： 将血竭经过氯仿、乙酸乙酯、乙醇回流提取得到的3种提取液，分别加入培养液并进行成纤维细胞的培养，MTT法检测不同血竭提取物在不同浓度以及不同时间点对体外培养成纤维细胞增殖的影响， 并绘制最适浓度条件下细胞生长曲线. 利用流式细胞仪分析最适浓度培养条件下成纤维细胞的细胞周期变化. 结果： 血竭乙酸乙酯提取物在0.5~2.0 g/L浓度范围内，促进成纤维细胞增殖，且呈剂量依赖性，在浓度为2.0 g/L时促进作用最为显著，此条件下处于S期的细胞较对照组增加18.3% (P<0.01). 结论： 血竭乙酸乙酯提取物能显著促进成纤维细胞增殖，可能与血竭促进创面愈合的机制有关.
【关键词】 血竭；成纤维细胞；细胞增殖；伤口愈合
0引言
血竭（Dragons blood）在我国传统医学中的应用悠久，具有活血化瘀、祛腐生肌、收敛止血、消肿止痛等功效［1］. 目前临床应用血竭及含有血竭的生肌药物难愈性创面，具有确切的疗效，但其作用机制尚不明确，以往的研究多在探讨血竭活血化瘀、改善创面血供方面的作用［2］，不能完全解释其促进创面愈合的作用机制. 成纤维细胞是创面修复过程中的最主要的功能细胞，在伤口愈合过程中经过迁移、增殖、分泌大量的胶原纤维和基质成份，与新生毛细血管等共同构成肉芽组织，填补组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件［3］. 国外学者Vaisberg等［4］已报道南美洲血竭提取物有促进成纤维细胞迁移的作用，但血竭对成纤维细胞增殖的影响，目前还未见报道. 本研究运用溶剂提取法制备血竭提取物，并作用于成纤维细胞，观察其对细胞增殖的影响,旨在进一步探讨血竭促进创面愈合的机制.
1材料和方法
1.1材料DMEM干粉培养基(高糖，Gibco，美国)；胎牛血清(杭州四季青公司)；DMSO（Sigma，美国）；MTT(Amresco，美国)；96孔板（COSTAR，美国）；CO2孵箱(Heraeus，上海)；倒置显微镜(Olympas)；酶联免疫检测仪(Labsystems，芬兰)；血竭（皇冠牌，印度尼西亚）；流式细胞仪(ELITEEsp Coulter).
1.2方法
1.2.1成纤维细胞分离培养实验所用正常皮肤成纤维细胞来源于健康人体皮肤，采用组织贴块法进行原代培养，实验用5～10代细胞.
1.2.2血竭提取物制备将血竭生药分别经氯仿、乙酸乙酯、950 mL/L乙醇依次回流提取，得到3种提取液分别为氯仿提取物（A），乙酸乙酯提取物（B）、乙醇提取物(C)，经水浴挥干溶剂，再分别以二甲基亚砜（DMSO）助溶得到浓度为200 g/L的溶液，流通蒸汽灭菌30 min，常温保存待用. 使用时将A, B, C 3种提取液分别溶解于DMEM培养液，配制成浓度为0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 g/L的溶液，所有溶液中DMSO含量均不高于1%. 实验分组： A组，B组，C组，D组 (含10 g/L DMSO的DMEM)，E组(DMEM).
1.2.3最适生长浓度筛选采用MTT比色分析法. 分别将对数生长期的成纤维细胞接种于96孔板，密度5×107/L，每孔200 μL，于37℃，50 mL/L CO2培养箱中孵育24~48 h，待细胞完全贴壁后，吸弃培养液，A, B, C组分别加入不同浓度（0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 g/L）血竭提取物条件培养液（150 μL/孔），D组加入含10 g/L DMSO的DMEM（150 μL/孔），E组加入DMEM培养液（150 μL/孔），每组均设6个平行孔及1个空白对照孔（用于检测时调零）. 于37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h后，每孔加5 g/L MTT试剂10 μL，孵箱中培养4 h， 吸弃培养液，加入DMSO（150 μL/孔），震荡10 min. 酶联免疫检测仪在450 nm波长下读取光吸收值A.
1.2.4细胞生长曲线测定应用MTT比色分析法（方法同上），取0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 h, 7个检测点，分为实验组（血竭提取物最适浓度）和对照组（DMEM），每组设6个附孔，用光吸收值A反映细胞数量，平均值并绘制生长曲线.
1.2.5细胞周期测定采用流式细胞仪，具体如下: 取8瓶对数生长期的成纤维细胞，每瓶计数约2.5×105. 弃去培养液，随机选取4瓶加入最适培养浓度血竭提取液各5 mL，另外4瓶作为对照组各加入5 mL DMEM培养液，在37℃, 50 mL/L CO2培养箱内孵育24 h，弃去药液及DMEM培养液，加入胰酶消化5 min，用含100 mL/L胎牛血清DMEM终止消化，收集细胞，1000 r/min离心5 min，加入PBS洗涤2次，离心(800~1000 r/min, 5 min)，弃上清，加入1 mL PBS将细胞团块吹散，再加入冰乙醇2 mL固定，碘化丙啶(PI)避光染色15 min，流式细胞仪检测细胞周期.
统计学处理： 实验数据以x±s表示，用SPSS11.0统计软件对多组间比较进行单因素方差分析以及LSDt检验,两组之间比较用t检验. P<0.05表示有统计学差异.
2结果
2.1成纤维细胞增殖各组培养液作用于成纤维细胞24 h后观察到，A组及C组各种浓度条件下测得光吸收值A与E组相比，均无显著差异(P>0.05). D组测得光吸收值A与E组相比，无显著差异(P>0.05). B组在浓度为1.0~4.0 g/L时，光吸收值A明显高于E组(P<0.01)，其中在0.5~2.0 g/L浓度范围内，呈浓度依赖关系，且在2.0 g/L浓度时A值最高，为血竭提取物促进成纤维细胞增殖的最适浓度.
2.2细胞形态学在血竭乙酸乙酯提取物浓度为2.0 g/L（促进成纤维细胞增殖的最适浓度）条件下，培养成纤维细胞24 h后直接镜下观察，细胞融合较对照组明显. 对照组细胞仅部分散在融合（图1）.
A: 对照组；B: 血竭乙酸乙酯提取物.
图1成纤维细胞生长情况×200（略）
2.3成纤维细胞生长曲线在血竭乙酸乙酯提取物浓度为2.0 g/L条件下培养成纤维细胞，可以观察到：加入药物12 h，实验组A值已明显高于对照组；随着时间点后移，12~36 h之间实验组与对照组间差异逐渐增大，36 h为实验组和对照组A值的峰值，此时两组间差异最为显著；从36~60 h之间，两组A值逐渐回落，但实验组仍高于对照组（图2）.
图2最适浓度（2.0 g/L）培养条件下成纤维细胞生长曲线（略）
2.4成纤维细胞细胞周期血竭乙酸乙酯提取物能增加处于S期的成纤维细胞比例. 在浓度2.0 g/L条件下培养24 h后，成纤维细胞处于G1期的比例明显低于对照组；S期的细胞比例则明显高于对照组，较对照组增加18.3 %（表1）.
表1血竭乙酸乙酯提取物对成纤维细胞细胞周期的影响（略）
bP<0.01 vs对照.
3讨论
血竭为祖国医学中皮肤疮疡和创伤的常用药物. 据颜燕艮统计，血竭是古籍医学记载的生肌类功效方剂中应用频率最高的药物［5］. 近年来，临床应用血竭治疗糖尿病性溃疡、褥疮、术后切口愈合不良等难愈性创面，具有良好的疗效. 目前，学者们将血竭的此类功效归结为其具有活血化瘀、抗菌消炎、促进表皮细胞游走、抗脂质过氧化等作用［6］. 本实验观察到，血竭乙酸乙酯提取物具有显著促进成纤维细胞增殖的作用.
血竭是来源于热带棕榈科黄藤属及百合科龙血树属等10多种植物的树脂类中药，成分复杂，主要含有血竭素、血竭红素等黄酮类化合物及三萜类化合物等［7］. 我们在实验中采取溶剂提取法经氯仿、乙酸乙酯和乙醇依次回流提取，将血竭成分进行初步分类，旨在缩小对血竭有效成分的研究范围. 实验中观察到，含低剂量DMSO的DMEM培养液对于成纤维细胞的增殖无明显作用，排除了助溶剂干扰实验结果的可能性. 本实验结果表明，氯仿及乙醇提取物对于成纤维细胞的增殖无明显作用，而乙酸乙酯提取物具有显著促进成纤维细胞增殖的作用，且在0.5~2.0 g/L浓度范围内呈浓度依赖关系. 据唐人九［8］报道，血竭经石油醚、氯仿、乙酸乙酯回流提取后，在乙酸乙酯部位可以分离到7，4’二羟基黄酮等黄酮类化合物，本实验中血竭乙酸乙酯提取物发挥作用的部分是否与黄酮类化合物有关，还有待进一步研究.
伤口愈合需要经过伤口收缩、肉芽组织填充与再上皮化3个过程［9］. 肉芽组织填充是创面愈合中的关键步骤，一般经过成纤维细胞激活、迁移、增殖及分泌细胞外基质等过程［10］，其中成纤维细胞增殖分化是最重要的细胞活动之一. 本实验观察到，在浓度为2.0 g/L时，血竭乙酸乙酯提取物对成纤维细胞具有显著促进增殖的作用，流式细胞仪检测发现细胞周期中G1期比例降低，S期比例明显增高，进一步证实了血竭上述作用. Vaisberg等［4］研究发现南美洲血竭提取物，可显著促进人成纤维细胞迁移，在我们以往的工作中还发现血竭乙酸乙酯提取物可以显著促进角质形成细胞的增殖［11］，另外陈德利［12］报道血竭提取物可促进角质形成细胞游走. 综上所述，我们认为血竭对于创面愈合过程中肉芽组织填充阶段成纤维细胞迁移、增殖的促进作用，以及对再上皮化阶段角质形成细胞迁移和增殖的促进作用，可能与其直接促进创面愈合的机制有关.
利用基础研究手段研究和解释中药药效以及分离和提取中药有效成分是中医药化进程中的关键环节. 本研究发现血竭乙酸乙酯提取物能够明显促进成纤维细胞增殖，为深入研究血竭促进伤口愈合的机制提供了理论依据.
【文献】
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