小鼠品系影响胚胎移植成功率的比较研究

             作者：张庆玲，贺莉，杨玉芳，李祖国，丁彦青

【关键词】  胚胎移植；动物,基因修饰；小鼠品系

       【Abstract】AIM:  To explore the relations of the strains of embryo and pseudopregnant recipient to live birth rate of embryo transfer and the feasibility of mixed transfer of different embryo strains. METHODS: A total of 362 embryos collected from 24 B6CF1 mice (F1 generation of Balb/c male and C578BL/6 emale mice) and 14 kunming (KM) mice were transferred into 24 mice of the 2 strains (8 B6CF1 mice and 16 KM mice)respectively for comparing the live birth rate. RESULTS: The birth rate of B6CF1 embryos transferred into the pseudopregnant mice of same strain were much higher (32.0%) than that of KM mice homogenous embryos (4.0%); the birth rate of mixed transferring of the 2 embryo strains were 25.0% of B6CF1 and 15.0% of KM mice. Except for homogenous embryo transfer, crossstrain embryo transfer was also performed in B6CF1 and KM mice. Among them, the total birth rate in embryotransferred B6CF1 pseudopregnant mice (29.0%) was obviously higher than that in KM pseudopregnant mice (7.0%). As for embryo strain, the birth rate of B6CF1 strain embryo transferring (16.0%) was higher than that of KM embryo transferring (11.0%). CONCLUSION: The live birth rate of embryo transfer could be elevated by selecting mouse strain cautiously. Both  crossstrain and mixedstrain embryo transfer are feasible, but homogenous embryo transfer is a priority. B6CF1 mouse is a better embryo transfer candidate than KM mouse.

    【Keywords】 embryo transfer; animals, genetically modified; mouse strains

    【摘要】目的： 探讨不同受体鼠和供体鼠品系对胚胎移植成功率的影响以及不同品系胚胎混合移植的可行性.  方法： 以Balb/c雄鼠和C57BL/6雌鼠杂交F1代（B6CF1）小鼠24只和昆明鼠（KM鼠）14只作为供体鼠，共取状态良好的受精卵362颗，分别或混合回种于8只B6CF1和16只KM受体鼠输卵管内，比较两种品系鼠的产仔率.   结果： 除同品系回种可产仔外，KM鼠和B6CF1杂交鼠受精卵交叉回种B6CF1或KM受体鼠以及两品系受精卵混合回种均可产仔. 其中B6CF1受体鼠产仔率（29.0%）明显高于KM受体鼠(7.0%)，B6CF1供体鼠产仔率（16.0%）也略高于KM供体鼠（11.0%）；杂交B6CF1受精卵同品系回种产仔率最高（32.0%），KM鼠受精卵同品系回种产仔率仅4.0%，而B6CF1和KM鼠作为受体鼠混合回种两品系受精卵的产仔率分别为25.0%和15.0%.   结论： 不同品系小鼠胚胎可交叉或混合回种，小鼠胚胎移植技术不受品系限制，但同品系胚胎移植成功率更高；B6CF1作为胚胎移植实验动物明显优于KM鼠.

    【关键词】 胚胎移植；动物，基因修饰；小鼠品系

    胚胎移植技术是制备转基因动物及其他显微操作工作的关键技术. 胚胎移植实验动物的选择直接影响移植效率和成功率. 小鼠是胚胎移植研究的主要实验动物之一. 不同品系小鼠对基因改造的反应区别非常明显［1］. C57BL/6和Balb/c小鼠是国际通用的近交系小鼠实验动物［2］. 昆明鼠（KM鼠）是我国自行培育的远交系小鼠，也是目前国内转基因实验研究对象之一. 国外有报道动物种系对转基因整合效率有一定影响［3］. 目前关于C57BL/6Balb/c杂交小鼠与KM鼠之间转基因和胚胎移植效率的比较研究及作为供体和受体鼠异同还较少报道. 为丰富KM鼠相关研究资料，探讨C57BL/6雌鼠和Balb/c雄鼠杂交F1代（B6CF1）和KM鼠作为供体鼠和受体鼠的异同，我们以此两种品系成年鼠为对象，分别进行了一系列相关比较分析.

    1材料和方法

    1.1材料健康、清洁级和远交系KM小鼠34只，6～10 wk龄，体质量16～22 g；健康、清洁级和近交系C57BL/6和Balb/c小鼠各10只，6～8 wk龄，体质量16～22 g；杂交培育B6CF1小鼠36只（灰色）（南方医科大学实验动物中心）. 孕马血清促性腺激素(PMSG，G4877, Sigma公司)；人绒毛膜促性腺激素(HCG，C1063, Sigma公司)；透明质酸酶(Sigma公司). 显微操纵仪（Nikon公司），体视显微镜、拉针仪和毛细玻璃管(Narishige公司)；CO2培养箱等.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养基的配制根据［4］自配HEPESCZB培养基和CZB培养基，于配制好当日取20颗状态良好的受精卵置于培养基内培养过夜，以超过80%卵发育成二细胞期为培养基合格标准，每次配制的培养基使用时间不超过40 d. 所有培养基在使用时均以矿物油覆盖.

    1.2.2超数排卵将8 wk龄B6CF1雌鼠或6～8 wk龄KM雌鼠作为供体鼠，PMSG和HCG间隔46～48 h注射，然后分别与B6CF1雄鼠或KM雄鼠同种交配，次日晨检查阴栓. 将有阴栓的雌鼠处死，收集超排卵，并于HEPESCZB培养基内轻柔洗涤5～7次，完全去除颗粒细胞，然后将卵置于CZB培养基内，于CO2孵箱内短暂培养30 min左右.

    1.2.3受体鼠选择和制备在供体鼠交配日同时选择发情期KM雌鼠或B6CF1雌鼠，分别与同系的结扎雄鼠交配，次日晨选择有明显阴栓的雌鼠作为受体鼠用于受精卵的回种.

    1.2.4胚胎移植分别选取短暂培养的状态好的超排受精卵，麻醉受体鼠，并于腰背部、肋骨和髂骨之间切开皮肤和肌肉，暴露并拉出卵巢和输卵管，体视显微镜下找到输卵管伞部，将受精卵通过输卵管伞部回种入受体鼠输卵管. 根据供体鼠和受体鼠的品系将回种组合分为3组.  ① 同品系卵回种：KM鼠卵回种于KM受体鼠，B6CF1鼠卵回种于B6CF1受体鼠；② 异品系卵回种：KM鼠卵回种于B6CF1受体鼠，B6CF1鼠卵回种于KM受体鼠；③ 混合卵回种：杂交鼠卵和KM鼠卵混合回种于KM受体鼠或B6CF1受体鼠. 另外，还根据回种卵的发育时期进行比较，包括单细胞期受精卵回种、单细胞期和二细胞期受精卵混合回种以及二细胞期受精卵回种.

    2结果

    2.1不同品系的受精卵回种不同品系的受精卵均可在回种19～21 d后产仔（图1~4），总产仔率为25/169（17.0%），单细胞期受精卵回种、单细胞期和二细胞期受精卵混合回种以及二细胞期受精卵回种情况下都可以成功产仔，单细胞期和二细胞期的受精卵同时回种于同一受体鼠，可于回种后第20日和第21日分别产下一仔.

    图1B6CF1母鼠同种B6CF1鼠卵（产2白3黑共5只B6CF1鼠仔）

    图2B6CF1母鼠回种KM鼠卵（产5只白色KM小鼠）

    图3KM母鼠回种B6CF1鼠卵（产3只B6CF1鼠仔）

    2.2受体鼠品系对回种成功率的影响分别以两种品系受体鼠和受精卵交叉回种，以及两品系卵混合回种于同一假孕母鼠后，B6CF1受体鼠接受回种后产仔成功率明显高于KM受体鼠，回种入B6CF1受体鼠的受精卵发育成小鼠的比例也明显高于KM受体鼠（表1）.图4KM母鼠回种同种KM鼠卵（产2只KM鼠仔）表1两种受体鼠品系回种成功率和产仔率比较

    2.3供体鼠品系对回种成功率影响B6CF1受精卵回种后产仔率比KM鼠稍高，两种品系卵混合回种产仔率略高于两种品系卵分别回种(表2).表2两种品系供体鼠的回种成功率比较

    2.4不同供体鼠和受体鼠品系配对情况下对回种成功率影响B6CF1的受精卵回种后产仔率明显高于KM鼠卵的回种产仔率. 其中，供体鼠和受体鼠均为B6CF1时，产仔率高于KM卵回种入B6CF1受体鼠和两种卵混合回种入B6CF1受体鼠；而不管供体鼠品系是B6CF1还是KM鼠或两种卵混合，KM受体鼠的产仔率都较低（表3）. 表3两种品系小鼠分别作为供体鼠和受体鼠进行配对其回种成功率比较

    3讨论

    转基因研究动物品系的选择受多方法和多因素影响，其中最重要的条件是动物的产仔率. 一般来说，远交系和杂交系产仔率比近交系卵移植产仔率更高. 而且有研究表明动物品系对转基因成功率和基因表达水平有明显影响［5-6］. 杂交鼠呈现一种“杂交优势”，与近交系小鼠相比异常卵比例低，生育能力有所增强，产仔数多. KM小鼠起源于远交系SWISS小鼠，于1946年由Haffine研究所引入云南昆明，经过半个多世纪的饲养繁殖，已成为我国目前使用最为广泛的小鼠，是我国独有的远交群实验动物［7］. 目前普遍认为KM远交系小鼠和杂交系小鼠均比近交系小鼠生殖能力好，产仔数多［8］. 已有的研究报道认为动物种系对转基因整合效率有一定影响，目前国内有报道C57BL/6和KM鼠的杂交F1代在转基因实验的基因整合方面优于KM鼠后代［9-10］，但是尚少见关于B6CF1小鼠与KM鼠之间胚胎移植成功率的比较研究. 而KM鼠具有价格相对低廉的优点，如果与国际通用实验动物比较，KM鼠胚胎移植效率没有差别，那么KM鼠将是很好的胚胎移植实验动物，至少可以作为一种很好的受体鼠，从而达到节约实验成本的目的，同时也可进一步丰富KM鼠作为供体鼠和受体鼠在胚胎移植方面的作用特点等相关实验资料.

    本研究表明，KM鼠超排卵数量和质量比B6CF1鼠高；而B6CF1小鼠作为受体鼠和供体鼠产仔率优于KM鼠. 因此杂交B6CF1代作为转基因对象强过KM鼠；在受体鼠品系不限的情况下，B6CF1鼠作为供体鼠其超排卵回种后发育成小鼠的比例高于KM鼠. 说明受体鼠品系对胚胎移植成功率的影响比供体鼠品系更大. KM鼠的卵同品种回种产仔率低于B6CF1代的卵和KM鼠卵混合回种入KM受体鼠，说明两种品系卵混合移植对移植产仔率也有一定影响，可能从另一个侧面提示卵本身品系对移植产仔率具有影响. 我们还尝试了不同发育时期（单细胞期和二细胞期）的受精卵同时回种于同一受体鼠，结果该受体鼠于回种后第20日和第21日分别产下一仔. 因此，我们认为小鼠胚胎移植不受品系和发育时期限制，但是品系对胚胎移植有显著影响，其中受体鼠品系对胚胎移植成功率的影响比供体鼠品系更大. B6CF1小鼠作为供体鼠和受体鼠的胚胎移植成功产仔率明显高于KM鼠，是比较好的转基因实验候选动物.

    【】

    ［1］ Fleming RE, CC Holden, Tomatsu S,  et al. Mouse strain differences determine severity of iron accumulation in Hfe knockout model of hereditary hemochromatosis［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(5):2707-2711.

    ［2］ Zhang GL, Srinivasan KN, Veeramani A, et al. PREDBALB/c: A system for the prediction of peptide binding to H2d molecules, a haplotype of the Balb/c mouse［J］. Nucleic Acids Res, 2005,33(Web Server issue): 180-183.

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    ［8］    胡秀兰，胡柏林，韩世亮，等.  武汉所昆明小鼠生产性能试验研究［J］. 中国实验动物学杂志, 2002,12(1):11-13.

    ［9］    陈占昆，吕厚山，艾京，等.  人β2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定［J］. 北京大学学报：医学版, 2001,33(4):366-369.

    ［10］    陈占昆，吕厚山，王东，等.  人类白细胞抗原B2704基因在转基因小鼠中的整合与表达［J］. 中华风湿病学杂志, 2005,9(6):321-324.