肺宁对大鼠博莱霉素肺损伤早期治疗作用的机制研究
【关键词】 肺宁；博莱霉素；肺泡炎；肺纤维化
【Abstract】 AIM: To study the effect of Chinese medicine Feining on early experimental pulmonary fibrosis in rats induced by bleomycin(BL). METHODS: All rats were randomly divided into control group, model group, Feining groups (dose:1, 2, 4 g/kg), prednisone group, and given BL endotracheally except the normal control group.On day 2, each BL group was given Feining and prednisone respectively. On day 7 and 14, 6 rats in each group were killed and lungs were harvested. The right lungs were subjected to histopathological studies(HE staining),the left lungs were homogenized for biochemical assays of SOD activity and MDA,GSH,TNFα contents. RESULTS: Compared to model group,alveolitis was alleviated in each Feining group significantly;on day 7, MDA, TNFα contents of homogenized lungs in each Feining group decreased(P<0.05), GSH content of homogenized lungs in the Feining(4 g/kg) group and prednisone group increased (P<0.05); on day 14, SOD activity, GSH content of homogenized lungs in each treated group increased (P<0.05), MDA contents decreased (P<0.05), TNFα content of homogenized lungs in the Feining (2, 4 g/kg) group decreased(P<0.05). CONCLUSION: The mechanism by which Feining resists pulmonary alveolitis is involved in promoting the activity of SOD, reducing lipid peroxide（LPO）mediated injury, enhancing the power of eliminating oxygen radical, improving the oxidation/deoxidation balance.Feining can prevent pulmonary fibrosis.
【Keywords】 feining; bleomycin; alveolitis; pulmonary fibrosis
【摘要】 目的： 观察中药肺宁对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化早期的防治作用. 方法： 以博莱霉素气管内注入建立肺纤维化模型，次日始分别给与中药肺宁和强的松灌胃，于给药第7, 14日处死动物，右肺组织行病理组织学检查，左肺组织匀浆进行超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、肿瘤坏死因子（TNFα）含量检测. 结果： 与博莱霉素对照组相比，肺宁不同剂量组肺泡炎的程度均明显减轻；7 d时肺宁各组肺组织匀浆MDA, TNFα含量降低（P<0.05），肺宁高剂量组(4 g/kg)、强的松组肺组织匀浆GSH含量升高（P<0.05）；14 d时肺宁各剂量组、强的松组肺组织匀浆SOD活力、GSH含量均增高（P<0.05），MDA含量降低（P<0.05），肺宁中剂量组(2 g/kg)、高剂量组(4 g/kg)TNFα含量降低（P<0.05）. 结论： 肺宁抗肺纤维化的作用机制与提高SOD的活性，降低脂质过氧化物（LPO）损伤有关，通过提高清除氧自由基能力，改善氧化/抗氧化平衡，对大鼠肺泡炎具有有效的治疗作用.
【关键词】 肺宁；博莱霉素；肺泡炎；肺纤维化
肺间质纤维化(肺纤维化)以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征. 目前仍缺乏理想的治疗药物. 西医治疗首选糖皮质激素，但长期应用可引起严重免疫及骨代谢疾病. 由于肺纤维化发病率、死亡率不断上升，近年来中药防治肺纤维化的研究成为肺疾患学科界关注的热点. 藏药紫花龙胆是龙胆科龙胆属植物龙胆类龙胆的花草，经鉴定为蓝玉簪龙胆（Gentiana Veitchiorum），藏药名榜间察吾. 《晶珠本草》记载龙胆花解毒治各种喉症，性味苦、寒无毒，主治咳嗽、气管炎、天花、咽喉肿痛等. 中药肺宁中的紫花龙胆含有龙胆苦甙成分，有保肝、利胆、抗炎、解痉止痛的作用. 我们把藏药龙胆花中龙胆苦甙粗提物制成浸膏，同时联合三七皂甙用于肺纤维化早期，对博莱霉素损伤早期的大鼠肺泡炎进行治疗，观察其抗炎效应，并讨论其临床价值.
1材料和方法
1.1材料SD大鼠72只，8 wk，雌雄各半，体质量（130±10）g，由第四军医大学实验动物中心提供. 博莱霉素粉针由日本株式会社生产，批号740130；强的松片由西安利君沙制药股份有限公司生产，批号20050110；肺宁由第四军医大学第三附属药剂科研制，主要成分为紫花龙胆和三七总甙，1 g肺宁稠膏相当于0.8521 g龙胆花生药，三七总甙含量为0.0762 g. 超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号20051123, 20050601, 20050601；肿瘤坏死因子（TNFα）试剂盒购自北京晶美公司，批号2005050531.
1.2方法72只动物随机分为6组① 正常对照组;② 模型组： 生理盐水灌胃；③ 肺宁（1 g/kg）低剂量组；④ 肺宁（2 g/kg）中剂量组；⑤ 肺宁（4 g/kg）高剂量组；⑥ 强的松组：将强的松片研成粉末，加蒸馏水溶解，参照［2］按6 mg/kg进行灌胃. 每组12只，雌雄各半. 采用博莱霉素（bleomycin, BLM）诱导实验性肺纤维化，文献［1］方法略作改进. 每只大鼠以200 g/L乌拉坦（5 mg/kg）腹腔内注射麻醉后固定于鼠板上，消毒后做颈部正中切口，暴露气管，经穿刺向气管内缓慢注入博莱霉素5 mg/kg (浓度10 g/L)或等量的生理盐水（正常对照组）,注射后迅速使动物直立并轻轻旋转，使药液在肺内均匀分布，缝合伤口，消毒，待动物清醒后常规饲养. 建模后第2日各组动物进行治疗. 所有实验动物每只灌胃量均为1 mL. 分别于造模后7, 14 d分2批腹主动脉放血处死各组动物，迅速取肺，左叶肺制成组织匀浆进行生化检测，右叶肺投入40 g/L甲醛中固定，常规包埋，切片，进行HE染色，光学显微镜下观察. 组织病参照文献［3］的方法，确定肺泡炎（HE染色）的程度,进行病理半定量分析. SOD, MDA, GSH测定均参照试剂盒说明进行. TNFα测定采用ELISA方法.
统计学处理: 计量数据均用x±s表示，采用SPSS11.0统计分析软件进行处理. 多组间比较及两两比较采用方差分析以及LSDt检验. 病理半定量结果多组间比较用KruskalWallis秩和检验，组间两两比较用MannWhitney U检验,此时校正检验水准α为0.01，即P<0.01认为两两组间差异有统计学意义.
2结果
2.1光镜下肺组织病理学的改变建模后第7日，模型组可观察到肺泡间隔水肿、出血、慢性炎性细胞浸润，可见浆细胞及少量的成纤维细胞，肺泡壁增厚，病变区肺泡结构破坏，大多呈2～3级肺泡炎改变；肺宁及强的松组肺泡炎显著减轻，多呈1～2级肺泡炎改变. 第14日，模型组肺泡间隔炎症细胞浸润程度严重，单核细胞及成纤维细胞较前增多且有毛细血管的增生，病变区肺泡结构破坏，肺泡腔消失，周围区域肺泡变大，肺泡隔变薄或断裂，大多呈3级肺泡炎改变. 肺宁各治疗组肺泡炎程度较博莱霉素对照组显著减轻，多呈0～2级肺泡炎改变. 强的松组肺泡隔增宽，间质水肿明显，部分大鼠肺部可见灶性脓肿，多呈1～2级肺泡炎改变. 正常对照组肺结构正常 （表1,图1）.表1实验小鼠肺泡炎等级分析(n=6)A：正常对照组；B：模型组；C：肺宁治疗组；D：强的松治疗组. 图1 光镜下肺组织病理学改变HE ×10
2.2肺组织匀浆SOD含量的变化建模后第7日，模型组SOD活性低于正常对照组（P<0.05）；肺宁各剂量组、强的松组SOD活力低于正常对照组（P<0.05），较模型组略低但无显著差异. 14 d模型组SOD活性仍低于正常对照组（P<0.05），肺宁各剂量组、强的松组SOD活力都高于模型组（P<0.05），与正常组相比无显著差异；肺宁各组之间均无显著性差异 （表2）. 表2实验大鼠7 d和14 d肺组织匀浆SOD活性,MDA, GSH, TNF-α含量
2.3肺组织匀浆GSH含量的变化建模后第7日, 模型组GSH含量低于正常对照组（P<0.05）；肺宁高剂量组、强的松组GSH含量高于模型组（P<0.05），也高于正常对照组（P<0.05）；肺宁高剂量组GSH含量高于强的松组（P<0.05），也高于肺宁中、低剂量组（P<0.05）. 第14日，模型组GSH含量低于正常对照组（P<0.05）；肺宁各剂量组和强的松组GSH含量均高于模型组（P<0.05），也高于正常对照组（P<0.05，表2）.
2.4肺组织匀浆MDA含量的变化建模后第7日，模型组MDA含量高于正常对照组（P<0.05）；肺宁各剂量组MDA含量低于模型组（P<0.05）；肺宁中、低剂量组MDA含量低于强的松组（P<0.05）. 第14日，模型组MDA含量仍高于正常对照组（P<0.05），肺宁各剂量组及强的松组MDA含量都低于模型组（P<0.05，表2）.
2.5肺组织匀浆TNFα含量的变化建模后第7日，模型组TNFα含量高于正常对照组（P<0.05）；肺宁各剂量组、强的松组TNFα含量低于模型组（P<0.05），也低于正常对照组（P<0.05）；肺宁高剂量组TNFα含量低于强的松组（P<0.05）. 第14日，模型组TNFα含量仍高于正常对照组（P<0.05）；肺宁中、高剂量组TNFα含量低于模型组（P<0.05），肺宁低剂量组也低于模型组但无显著差异；肺宁高剂量组TNFα含量仍低于强的松组同时也低于肺宁低剂量组（P<0.05，表2）.
3讨论
我们在先前的实验中发现，肺宁水煎液在1 g/kg剂量下连续灌胃给予肺纤维化模型大鼠28 d，对肺纤维化病变的病理和生化指标有较好的改善作用［3］. 为此我们进一步研究肺宁浸膏在肺纤维化形成早期的作用. 肺泡炎是BLM 致肺纤维化损伤的早期表现，BLM肺纤维化模型的病理演变能较好的再现人类间质性肺纤维化病情进展的全过程，是目前国内外研究肺纤维化的理想模型［4-5］. 本实验观察到，模型组肺组织形态学观察多呈2~3级肺泡炎表现，肺宁各治疗组肺泡炎程度呈 0~2级肺泡炎表现，炎性细胞浸润明显减轻（P<0.01）. 说明肺宁可削弱炎症反应，减少炎症细胞的渗出，在肺纤维化形成的早期发挥作用.
有研究表明肺泡巨噬细胞脂质过氧化损伤是BLM致肺泡炎损伤的机制之一［7］. 实验结果显示模型组MDA含量高于正常对照组，SOD活性低于正常对照组（P<0.05），提示自由基损伤至少是肺纤维化形成机制中的一个重要环节. 肺损伤大鼠经治疗后，肺宁各治疗组MDA含量低于模型组，SOD活力、GSH含量高于模型组（P<0.05），尤以肺宁高剂量组效果较好，GSH含量高于强的松组也高于正常对照组（P<0.05），说明肺宁可减轻脂质过氧化反应，清除自由基抑制自由基生成.
本实验观察到BLM导致肺组织TNFα表达增加，TNFα表达水平随着时间延长下降，但TNFα的表达仍持续高于正常对照组，这表明TNFα的持续高水平表达参与了肺组织的急性炎症损伤和炎症慢性转化过程. TNFα作为一种前炎性细胞因子在BLM致肺损伤早期肺泡炎中起重要作用，可诱导中性粒细胞（PMN）的局部浸润，释放大量的具有氧化活性的物质超氧阴离子(O2-)，羟自由基（OH-）等，攻击细胞膜中不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物及其降解产物MDA等，破坏肺组织结构，加重炎症损伤. 有研究表明TNFα可诱导血小板活化因子,IL1,IL8等致纤维化因子的释放，抑制肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质分泌［8］. 本实验大鼠经治疗后，肺宁各组TNFα含量低于模型组（P<0.05）也低于正常对照组（P<0.05），尤以肺宁高剂量组效果明显，TNFα含量低于强的松组（P<0.05）. 因此肺宁可通过影响TNFα的表达水平有效地减轻炎性细胞的浸润、活化，从而防止大量自由基对肺组织的损伤.
目前对于肺纤维化的治疗及逆转其病理变化的还缺少可靠的药物. 中药肺宁的主要成分是龙胆苦甙和三七总甙. 龙胆苦甙具有促进胃液分泌、抗炎、保肝、利胆等作用. 三七总皂甙对急性炎症的毛细血管通透性增加、炎性渗出、组织水肿有抑制作用. 李学军等［9］证明三七总甙具有抗肺纤维化的作用. 本实验说明肺宁可使肺损伤大鼠肺组织匀浆中TNFα水平下调，减轻脂质过氧化反应，清除自由基抑制自由基生成，并削弱炎症反应，减少炎症细胞的渗出，在肺纤维化形成的早期发挥作用，提示其治疗作用机制是抑制前炎症细胞因子TNFα表达，改善氧化与抗氧化平衡，抑制炎症反应，以达到减轻或抑制肺纤维化的形成.
本实验结果显示肺宁高剂量组较强的松有更好的疗效，但治疗作用无明显的剂量依赖性. 肺宁作为一种中药有药理作用温和、毒副作用少等特点. 但由于龙胆花粗提物中化学成分较为复杂，故肺宁抗肺纤维化的药理作用可能是通过多种途径实现的，各环节间的相互影响尚有待进一步研究.
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