肺癌组织凋亡相关基因的表达意义

           作者：王述民，马颖艳，程庆书

【关键词】  肺肿瘤；癌基因；TUNEL；免疫组织化学；基因表达

    【Abstract】 AIM: To discuss the expressions of the apoptosisrelated oncogenes Fas, Bcl2, Bax and p53 in lung cancer tissues and their significance, in order to provide the theoretical basis for the molecular biological study. METHODS： The expressions of  p53, Bcl2, Bax and Fas proteins in 57 cases of lung cancer were detected by the immunohistochemical technique and TUNEL. RESULTS： The expression rates of Bcl2, p53, Bax, Fas proteins in lung cancer tissues were 33%, 69%,70% and 28%, respectively,and the expression rate of each apoptosisrelated oncogene was different in lung cancer tissues of the different pathologic types. There was no definite relationship between the lymph node metastasis and the apoptosisrelated oncogenes（P<0.05）. With the rising of the pathologic staging of the tumor ,  the expressions of  p53 and Fas proteins increased, while the expression of Bcl2 decreased. There seemed to be no definite relationship between the expression of Bax protein and the pathological staging（P<0.05）.CONCLUSION： There are the apoptosisrelated oncogene expressions in lung cancer tissues, and their expression degree is related with their pathological types. The overexpressions of  p53 and Fas proteins may be associated with the bad prognosis of lung cancer.

    【Keywords】 lung neoplasms; oncogenes; TUNEL; immunohistochemistry; gene expression

    【摘要】 目的： 探讨肺癌组织中凋亡相关基因Fas，Bax，p53，Bcl2蛋白的表达意义，为进行肺癌的分子生物学研究提供理论依据. 方法： 应用原位末端DNA片段标记法（TUNEL），结合免疫组化技术对57例肺癌切除标本进行Fas，Bax，p53及Bcl2蛋白检测. 结果： 在肺癌组织中凋亡相关基因阳性率分别为：Fas 28%，Bax 70%，p53 69%，Bcl2 33%，各基因在肺癌不同病理类型中表达率亦不同，且肺癌的淋巴结转移与调亡相关基因表达无明显关系（P<0.05）. 其中，p53，Fas随肺癌病理分期的升高而增加，Bcl2则随病理分期的升高而减少，而Bax则与病理分期无明显关系(P<0.05).  结论： 肺癌组织有调亡相关基因表达，其表达程度与肺癌的病理类型有关，p53, Fas表达可能与不良预后有关.

    【关键词】 肺肿瘤；癌基因；TUNEL；免疫组织化学；基因表达

    肺癌的发病率逐年升高，从分子水平进一步阐明肺癌的发生和，对其防治具有一定的意义. Fas，Bax，p53及Bcl2均为凋亡相关基因，在肺癌组织中的表达情况报道尚少. 我们应用原位末端DNA片段标记法（TUNEL），结合免疫组化技术，检测了57例肺癌石蜡包埋组织中Fas，Bax，p53，Bcl2蛋白的表达情况，探讨其彼此之间的关系及其与临床分期、预后的关系，为进一步进行肺癌的凋亡研究提供理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料第四军医大学唐都胸外科手术切除标本57（男43，女14）例，年龄36~73（53.4±1.8）岁. 其中小细胞肺癌14例，腺癌21例（低分化腺癌11例，高分化腺癌10例），鳞癌22例（低分化鳞癌10例，高分化鳞癌12例）. 根据手术病理诊断按国际抗癌联盟分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲa期17例，Ⅳb期12例，Ⅴ期10例. SABC试剂盒购自广州华美公司，兔抗Fas多克隆抗体，鼠抗Bcl2 mAb，兔抗Bax多克隆抗体及p53 mAb均购自Doka公司，TUNEL试剂盒购自Sigma公司. 常规100 g/L甲醛固定，石蜡包埋，选取典型病变蜡块作为研究对象. 肺癌组织学类型按WHO标准分类［1］.

    1.2方法Fas，Bcl2，Bax，p53蛋白的表达均采用肺癌组织石蜡切片免疫组化染色SABC法［2］. TUNEL染色按试剂盒说明操作. 光镜下从染色强度和阳性细胞比例两方面评价染色结果. 标本无阳性反应细胞，或背景同空白对照为阴性(-)，标本阳性细胞呈淡棕黄色或深棕色.

    统计学方法： 统计阳性标本例数，计数阳性率，率的比较用χ2检验， P<0.05为有统计学差异.

    2结果

    肺癌组织Fas表达阳性28%(图1A)，其中鳞癌43%阳性，腺癌21%阳性，小细胞肺癌21%阳性. 肺癌Bcl2 33%阳性表达(图1B)，其中小细胞肺癌71%，腺癌21%，鳞癌23%. 小细胞肺癌Bcl2阳性表达率明显高于腺癌和鳞癌(P<0.01)，而小细胞肺癌的凋亡细胞数(3.7±0.7)仅仅略低于腺癌的(4.7±0.6)和鳞癌的(4.3±0.8).  肺癌Bax阳性70%(图1C)，Bax在各型肺癌中均呈现高表达率，虽然表达程度有所差异，但无统计学意义. 癌旁组织中也有Bax的阳性表达. 低Bcl2/Bax的组织中凋亡率高于Bcl2/Bax较高的组织(P<0.05). 肺癌p53阳性69%(图1D)，其中，鳞癌68%，腺癌67%，小细胞肺癌64%，在小细胞肺癌和非小细胞肺癌中，p53阳性组凋亡细胞略低于p53阴性组，但两者之间均无显著性差异. 肺癌的淋巴结转移与Fas，Bcl2，Bax，p53表达无明显关系(P>0.05)，在肺鳞癌和腺癌中，p53蛋白过度表达随病理分期的升高而增加；Bcl2过度表达则正相反，随病理分期的升高而降低，Fas过度表达亦随病理分期的升高而增加，而Bax表达与病理分期无明显关系(P>0.05，表1).

    TUNEL原位末端标记荧光法见肺癌组织内散在点状荧光（图2），显示散在分布的凋亡细胞. 未出现凋亡的细胞荧光呈阴性.

    3讨论

    细胞癌变是一个多因子、多步骤的复杂生物学过程，与癌基因激活和抑癌基因的失活密切相关. 随着肺癌生物学研究的进展，基因诊断将为早期的肺癌诊断提供理论依据和实验手段. TUNEL法是目前国际公认的检测凋亡细胞的比较敏感的新技术，该法将分子生物学与免疫组织化学相结合，通过标记单链DNA片段而在组织切片或细胞涂片上显示凋亡细胞. 较单纯形态学观察，敏感性及特异性均高，且能准确地对凋亡细胞作定量研究. 我们用此种方法研究了各种肺癌中凋亡细胞的情况，结果发现TUNEL染色后，凋亡细胞呈荧光阳性，非凋亡细胞呈荧光阴性，在荧光显微镜下观察图像清晰.

    A：p53SABC ×100; B: BaxSABC ×100; C: FasSABC ×100; D: Bcl2SABC ×200.

    图1肺癌组织基因表达表1肺癌淋巴结转移和病理分期与Fas，Bcl2，Bax，p53表达的关系

    本组p53，Fas，Bax, Bcl2蛋白各自在各种肺癌中均有不同程度的表达，提示了肺癌的发生涉及多基因的激活和失活. p53过度表达与鳞癌、腺癌和小细胞癌的分化程度有关，分化越差，阳性率越高，与国内外报道一致［3-5］. NSCLC(9/43)中Bcl2蛋白阳性过度表达率远较SCLC(10/14)低，这可能与它们不同的生物学属性有关．此外，Bcl2表达与肺癌的组织分化程度有关，随着分化程度的提高，过度表达率增高(P<0.05),这与分化程度低者多伴有坏死等有关. Fas过度表达在肺鳞癌中较高9/22(43%)，显著高于肺腺癌和小细胞癌，提示Fas系统在鳞癌和其他肺癌的发生中可能起着不同的作用，Fas系统可能是介导鳞癌细胞凋亡的主要途径. Bax蛋白的过度表达在各种肺癌组织中无明显差异.

    目前认为肺肿瘤的发生是正常细胞多重损伤的复杂过程，且往往形成两种或两种以上肿瘤基因激活的结果. 我们的实验大多数病例有一种以上蛋白表达，含有两种以上蛋白表达病例数为38例. p53与Bcl2表达在肺癌分化程度中呈负相关. 肺癌分化程度越低，p53过度表达率越高，而Bcl2过度表达率越低；肺癌的分化程度越高，p53蛋白过度表达率越低而Bcl2过度表达率越高，说明肺癌细胞凋亡调控是通过p53基因突变而对Bcl2蛋白产生负调节所致. 随着肿瘤分子生物学的，通过检测肿瘤中的癌基因的表达来诊断及判断预后的方法也逐渐被人们所认识，这也为进行肺癌的凋亡研究提供理论依据.

    【】

    ［1］ 孟宇宏，李维华.  肺和胸膜肿瘤的组织学分类［J］. 诊断病杂志，2000,7（2）:156-157.

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