靶向COX

           作者：谯敏，向廷秀，王丕龙，黄爱龙

【关键词】  RNA干扰；环氧化酶

    【Abstract】AIM: To investigate the inhibitory effect of siRNA targeting COX2 on the growth of  gastric carcinoma cells of well, moderate or  poor differentiation (MKN28, SGC7901, BGC823) and related mechanism. METHODS: siRNA targeting COX2 gene was designed, siRNACOX2 vector was constructed and transfected into gastric carcinoma cells to induce RNA interference. The changes of COX2  were detected with RTPCR and Western blotting.Cell viability was detected by MTT. Cell apoptosis was  judged by TUNEL and electromicroscopy, and expressions of Bax and Bcl2 were tested by Western blot. RESULTS: Both COX2 expression and cell growth were inhibited in SGC7901 and BGC823 after transfection of siRNACOX2 vector into the cells. But, in MKN28 ,only COX2 expression decreased. The obvious cell apoptosis both in SGC7901 and BGC823 was observed. Bax was upregulated and Bcl2 was downregulated in SGC7901 and BGC823. In contrast, there were almost no changes in control group in vitro. CONCLUSION:  RNA interference inhibits the growth of gastric carcinoma cells, which may be related to downregulation of COX2 and induction of cell apoptosis. The inhibitory effect of RNAi was relatively strong in SGC7901, which indicated that the effect of siRNA was dependent on  the differentiation degree of gastric carcinoma cells.

    【Keywords】 RNA interference; COX2; cell proliferation; apoptosis; stomach neoplasms

    【摘要】目的： 利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术在体外抑制COX2表达，研究其抑制三种不同分化程度的胃癌细胞（MKN28，SGC7901，BGC823）的可能性，探讨RNAi抑制胃癌生长与胃癌细胞分化程度的相关性. 方法： 设计靶向COX2基因的siRNA，构建重组表达质粒pTZU6+1siRNACOX2并导入胃癌细胞株，体外诱导RNAi，采用逆转录PCR（RTPCR）和Western blotting检测COX2基因表达变化,MTT法检测细胞活力,原位末端标记（TUNEL）及透射电镜检测细胞凋亡，Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl2的改变. 结果： pTZU6+1siRNACOX2质粒导入细胞后，SGC7901和BGC823中COX2表达明显下调，细胞生长被抑制，并出现特征性的细胞凋亡，同时有Bax蛋白上调和Bcl2蛋白下调. 对照组则无明显变化. 结论： RNAi显著抑制胃癌细胞生长，可能与下调COX2基因表达和诱导细胞凋亡有关,其对中分化胃癌细胞的抑制作用最为显著，提示RNAi的作用可能依赖于胃癌细胞的分化程度.

    【关键词】 RNA干扰；环氧化酶2；细胞增殖；细胞凋亡；胃肿瘤

      环氧化酶（Cyclooxygenase, COX）是花生四烯酸(arachidonic acid, AA)合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的限速酶，其有两种同工酶. COX1是在正常组织中表达的结构型酶；COX2是诱导型酶，正常生理状态下表达甚少，而在各种刺激因子存在时表达增加. 有研究表明，COX2在胃癌中高表达［1］. 我们依据RNA干扰（RNA interference, RNAi）原理，以真核表达质粒pTZU6+1为载体［2］，设计并构建靶向COX2基因的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA), 作用于三种分化程度不同的胃癌细胞株，研究COX2基因特异的siRNA对胃癌细胞生长的抑制、可能的作用机制以及与胃癌细胞株分化程度的相关性，为COX2抑制剂应用于胃癌提供理论基础.

    1材料和方法

    1.1材料中分化胃癌细胞株SGC7901和低分化胃癌细胞株BGC823细胞株由重庆医科大学病理生教研室提供；高分化胃癌细胞株MKN28细胞株购自上海消化疾病研究所；质粒pTZU6+1由重庆医科大学感染性疾病重点实验室黄爱龙教授惠赠；限制性内切酶XbaI, SalI, HindIII和EcoRI以及连接试剂盒购自美国TakaRa公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自美国Promega公司；总RNA提取试剂、RTPCR试剂盒购自美国Qiagen公司；转染试剂lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；COX2，Bax和Bcl2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；COX2引物和内参GAPDH引物以及siRNA转录模板由北京三博远志生物工程技术有限服务公司和大连宝生物公司合成.

    1.2方法

    1.2.1siRNA结构的设计和合成根据siRNA设计原则［3］和COX2编码序列，设计19nt的DNA片段，中间为4个碱基的与目的基因无同源性的插入序列(TTCG)，末端终止子为TTTTT，并利用BLAST进行查询，确定其为特异性序列. 合成的DNA两端设计有XhoI或XbaI酶切位点，便于与pTZU6＋1载体连接. 设计合成pTZU6+1siRNACOX2转录模板序列（正义：5′ GCCTT CTCTAACCTCTCCT3′，反义：5′AGGAGA GGTTAGAGAAGGC 3′）；相应合成的干扰序列（正义：5′TCGAGGCCTTCTCTAACCTCTCCTTTCGAGGAGAGGTTAGAGAAGGCT TT TT3′）（反义：5′CTGAGAAAAAAGCCTTCTCTAACCTCTCCTCGAAA GGAGAGGTTAGA GAAGGCC3′）.

    1.2.2重组载体siRNA的构建内切酶SalI和XbaI酶切转录载体pTZU6+1，然后与纯化的双链DNA片段在T4 DNA连接酶作用下，4℃连接过夜，转化大肠肝菌JM109，Amp抗性筛选. 筛选克隆提取DNA，用EcoRI和HindIII双酶切，并用相同的酶酶切载体pTZU6+1作为对照，琼脂糖凝胶电泳并测序鉴定. 构建的重组质粒命名为pTZU6+1siRNACOX2（简称siRNACOX2）.

    1.2.3质粒转染细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液, 37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养. 转染时，将细胞消化、离心并重悬后稀释为1×109个/L，以2 mL/孔接种于6孔培养板中，置37℃培养过夜. 于次日用siRNACOX2分别转染三种细胞，同时设pTZU6+1空载体转染的阴性对照和只接种细胞，不作处理的空白对照. 在无血清、无抗生素的RPMI1640培养液培养4~6 h后换新鲜的含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液，继续培养2~4 d 后检测各指标.

    1.2.4RT PCR检测COX2 mRNA采用RTPCR一步法试剂盒. 反应条件为50℃， 30 min，94℃ 5 min， 94℃  55 s， 54℃  55 s， 72℃ 55 s， 35循环. 以GAPDH作为内参，并设相应的阴性对照和空白对照. 扩增的COX2长度为270 bp，GAPDH长度为821 bp. 扩增产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳30 min，EB染色，用BIORAD图像分析仪上观察并扫描制片，记录结果.

    1.2.5Western blotting检测COX2，Bax和Bcl2蛋白配制100 mg/L的SDSPAGE分离胶和50 mg/L的SDSPAGE浓缩胶. 收集对照组和转染siRNACOX2质粒48  h的三种细胞，沉淀用PBS洗2遍，细菌裂解液处理，混匀，上样10  μL，90 V恒压电泳约60 min，120 V恒压电泳约2 h，4℃，25 V恒压电转过夜. 次晨取出硝酸纤维素（NC）膜，1∶500稀释的一抗溶液，4℃过夜，1∶1000稀释的二抗溶液，37℃，轻轻振荡2 h后弃反应液. DAB染色试剂盒染色，BIORAD图像分析仪观察并扫描制片，记录结果.

    1.2.6MTT法分别将对数生长期的三种细胞以5×107/L接种于96孔培养板中，每孔200  μL，常规培养24 h后加上处理因素，每组设4个复孔，并设阴性对照组. 继续培养1~ 4 d，每孔分别加入5 g/L的MTT 20 μL，37℃孵育 4 h后弃去上清，每孔均加入二甲基亚砜100 μL，轻微振荡使紫蓝色沉淀溶解. 用酶标仪测定A490 nm，每组细胞增殖的抑制率（IR）以及中效浓度. 并在倒置显微镜下观察各组细胞形态. IR=（l-试验孔A/对照组A）× 100%.

    1.2.7TUNEL采用TUNEL反应检测试剂盒，分别取对数生长期的三种细胞4 ×105接种于6孔板，完全培养基培养过夜，分组转染细胞. 转染后72 h，弃上清，用950 mL/L乙醇固定，30 mL/L的H2O2封闭，1 mL/L Triton100,每孔加50 μL反应混合液,37℃孵育60 min,每孔加50 mL POD,最后用DAB显色. 同时设立阴性对照.

    1.2.8电镜观察分别收集阴性对照和转染siRNACOX2质粒48 h的三种细胞，制成超薄切片，拘檬酸铅染色，透射电镜观察细胞超微结构的变化并摄片.

    统计学处理： 数据均以x±s表示，采用SAS8.0统计软件进行数据处理，对所得的各组数据进行方差齐性检验，方差齐时用t检验对各组转染前后的差别进行探索性分析.

    2结果

    2.1重组质粒载体鉴定琼脂糖电泳pTZU6+1空载体经双酶切后呈两条带，分别为2.8 kb的载体片段和350 bp左右的小片段；而构建质粒则为2.8 kb的载体片段和400 bp左右的目的片段. 测序结果均正确.

    2.2RT PCR以琼脂糖电泳条带的亮度来判断COX2的mRNA表达高低. 与对照组相比，siRNACOX2质粒转染后的MKN28，SGC7901和BGC823细胞中COX2的 mRNA分别下调82.34%,91.32%和86.88%（图1）.

    1：SGC7901阴性对照；2：siRNACOX2转染的SGC7901；3：MKN28阴性对照；4：siRNA COX2转染的MKN28；5：BGC823阴性对照；6：siRNA COX2转染的BGC823；7：空白对照；8：DL2000 Marker.

    2.3Western blotting以βactin蛋白特异反应条的亮度带作为标准，与对照组相比较，转染siRNACOX2质粒后的MKN28, SGC7901和BGC823细胞中，COX2蛋白表达分别下降86.67%, 94.67%和90.29%. 同时，Bax反应条带明显增强，而Bcl2蛋白表达下调（图2）.

    1：SGC7901阴性对照；2：MKN28阴性对照；3：BGC823阴性对照；4：siRNA COX2转染的SGC7901；5：siRNA COX2转染的MKN28；6： siRNA COX2转染的BGC823.

    图2胃癌SGC7901细胞中COX2，Bcl2和Bax蛋白表达

    2.4MTT实验与对照组相比较，转染siRNACOX2质粒的SGC7901和BGC823组细胞增殖速度减慢，且呈时间依赖方式，在转染重组质粒后的第4日抑制作用最为明显（表1）. 而转染siRNACOX2质粒的MKN28细胞生长抑制不明显,与对照组相比,抑制率无显著性差异.表1siRNACOX2转染后第4日三种胃癌细胞的抑制率

    2.5TUNEL反应检测SGC7901细胞核内的片段化对照组细胞大部分贴避良好,形态完整正常,少量胞核内有着色现象,胞质着色浅. 在转染siRNACOX2的SGC7901和BGC823细胞中出现大量凋亡细胞，细胞核中央呈圆形、均一的棕色,在胞浆中有片状着色，核浓缩. 而在转染siRNACOX2后的MKN28细胞中仅发现数量很少的凋亡细胞（图3）.

    2.6电镜观察细胞凋亡与对照组细胞相比较,siRNACOX2质粒转染的SGC7901和BGC823均出现细胞体积明显缩小，细胞表面微绒毛显著减少甚至消失；细胞膜上出现一些小泡；胞质内结构密度增大，胞质肿胀，内质网和线粒体等细胞器可辨认，其数目减少. 细胞核固缩,核膜皱沼完整，核内染色质浓集成块，有的呈月牙状，边集在核膜下，可见一些由膜状物包裹的小体，内含残存的染色质和退变的细胞器. 而在siRNACOX2质粒转染后的MKN28细胞中并未发现典型的凋亡细胞（图4）.

     3讨论

    RNAi 是Fire等［4］在1998年研究Caenorhabditis elegans基因组计划时，发现并命名的新技术. Elbashir等［5］证实在哺乳动物细胞中可以应用RNAi技术，揭开了RNAi应用于哺乳细胞研究的新篇章. 目前已知的合成siRNA的方式有多种,包括化学合成、质粒载体转录生成、病毒载体转录生成等,相比之下,质粒载体转录生成siRNA的方式更便宜和安全,操作也更简便.

    本研究采用体外转录方式,并根据siRNA的设计原则［3］，将含转录启动子的真核表达载体pTZU6+1与针对COX2基因设计的siRNA相连接，成功地构建了重组转录载体pTZU6+1siRNACOX2，并导入不同分化程度的胃癌细胞株后均能显著抑制COX2表达，说明siRNA对胃癌细胞中COX2的抑制作用特异而完全. 当COX2表达下调后，大部分SGC7901和BGC823细胞生长明显被抑制，但MKN28细胞生长抑制不明显，提示RNAi抑制胃癌细胞生长作用的强弱可能与肿瘤细胞的分化程度有一定的相关性. 由此推测，靶向COX2的RNAi对胃癌细胞生长的抑制作用不仅与特异性地抑制COX2活性有关，还与肿瘤细胞本身的生物学特性密切相关. 在MKN28细胞，可能因其调控肿瘤生长的分子生物学机制不同，启动或激活了其他的信号传导通路，从而促使肿瘤细胞分化或继续增殖［6］. 同一组织来源的不同分化程度的肿瘤细胞可能有着不同的生物学特性，对同一种处理因素可能有不同的敏感性. 因此通过抑制COX2活性来胃癌不一定对各型胃癌均有效. 这是将RNA干扰技术应用于肿瘤基因治疗时值得关注的问题.

    本研究中还发现，RNA干扰能显著诱导胃癌细胞凋亡，这与Uefuji等［7］的研究结果一致. Bcl2基因家族是细胞凋亡过程中的主要调控基因，其中Bcl2是已发现的最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因，其同源基因Bax可拮抗Bcl2的保护效应而使细胞趋于凋亡［8］. 我们的实验结果表明siRNA可以上调Bax和下调Bcl2表达，这可能为RNA干扰诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制提供了有用信息.

    综上所述,本研究成功构建了重组表达质粒pTZU6+1siRNACOX2，发现其能明显抑制胃癌细胞株中COX2表达,并抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡,为肿瘤的基因沉默治疗提供了新的思路.

    【】

    ［1］Xue YW, Zhang QF, Zhu ZB, et al. expression of cyclooxygenase2 and clinicopathologic features in human gastric adenocarcinoma ［J］.World J Gastroenterol, 2003,9(2):250-253.

    ［2］Sui G, Soohoo C, Affar B, et al. A DNA vectorbased RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells［J］ . Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(8):5515-5520.

    ［3］Tuschl T. Expanding small RNA interference ［J］. Nat Biotechnol, 2002,20:446-448.

    ［4］Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］. Nature, 1998,391(6669):806-811.

    ［5］Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21and 22nucleotide RNAs ［J］. Genes Dev,  2001,15(2):188-200.

    ［6］Surh YJ, Kundu JK. Signal transduction network leading to COX2 induction: A road map in search of cancer chemopreventives ［J］. Arch Pharm Res, 2005,28(1):1-15.

    ［7］Uefuji K, Ichikura T, Mochizuki H. Expression of cyclooxygenase2 in human gastric adenomas and adenocarcinomas［J］. J Surg Oncol, 2001,76(1):26-30.

    ［8］Forones NM, Carvalho AP, GiannottiFilho O, et al. Cell proliferation and apoptosis in gastric cancer and intestinal metaplasia ［J］. Arq Gastroenterol, 2005,42(1):30-34.