T细胞激活剂对Jurkat 细胞重组激活基因表达的影响

         作者：邹红云，马骊，姚新生，温茜，王小宁

【关键词】  T细胞激活剂,；Jurkat细胞；重组激活基因；逆转录聚合酶链反应

    【Abstract】 AIM:  To investigate the effects of T cell activators on the mRNA expression of recombinationactivating genes (RAGs) in Jurkat cells. METHODS:  After Jurkat cells were treated with PHA (20 mg/L), antiCD3 mAb (1∶100), PMA(40 μg/L)+A23187 (0.5 μmol/L) for 6 and 12 h respectively, RAG1 and RAG2 mRNA were measured by RTPCR. Semiquantitative analysis was used to evaluate RAG1 and RAG2 mRNA levels in different groups.  RESULTS:  Compared with the control groups, the levels of  RAG1 mRNA  were  significantly lower in different treated groups (P<0.05), and RAG1 mRNA levels were  associated with treatment time. RAG2 mRNA levels in PHA treated groups were significantly lower than those  in the control groups (P<0.05). No RAG2 mRNA was detected in PMA+A23187 treated groups. However, RAG2 mRNA level was significantly higher in antiCD3 mAb (12 h) treated group than that in control groups(P<0.05). CONCLUSION：  RAG1 and RAG2 mRNA were coexpressed in Jurkat cells and could be regulated by T cell activators. The results may give a clue  that Jurkat cells maybe provide an ideal cell line model for studying the regulation of RAGs in peripheral T cells.

    【Keywords】 T cell activators; Jurkat cells; recombinationactivating genes; reverse transcriptase polymerase chain reaction

    【摘要】 目的：  研究T细胞激活剂PHA，抗CD3 mAb, PMA+A23187对人T细胞白血病细胞株Jurkat重组激活基因（RAGs ）mRNA表达水平的影响.  方法： 采用RTPCR法检测不同T细胞激活剂作用不同时间后Jurkat 细胞中RAG1, RAG2 mRNA，以β肌动蛋白（βactin）的表达作为内参照进行灰度分析，比较不同组Jurkat细胞RAGs mRNA的表达水平 .  结果： 三种T细胞激活剂刺激诱导的Jurkat细胞RAG1 mRNA表达量明显低于对照组（P<0.05），且RAG1 mRNA表达量的下降与刺激诱导作用时间有关；PHA刺激诱导后RAG2表达量显著低于对照组（P<0.05）；PMA+A23187刺激诱导6, 12 h均未检测出RAG2 mRNA的表达； 而抗CD3 mAb作用12 h组RAG2 mRNA表达量显著高于对照组（P<0.05）.  结论：  Jurkat细胞同时表达RAG1, RAG2 mRNA，并在一定诱导下RAGs表达量发生改变，因此有可能成为研究外周T细胞RAGs表达调节的一个潜在的细胞模型.

    【关键词】  T细胞激活剂 ；Jurkat细胞；重组激活基因；逆转录聚合酶链反应

     淋巴细胞特异性重组激活基因（recombination activating genes， RAG）1和RAG2是参与V(D)J重排和功能性抗原受体基因形成的一个首要条件［1］. 一般认为，RAG1, RAG2基因仅特异性地同时表达于淋巴细胞发育的早期阶段，而不表达于淋巴细胞分化发育的较成熟阶段. 然而，近年的研究发现，外周成熟淋巴细胞中也有RAGs表达和V(D)J重排的发生［2-3］. 迄今，外周淋巴细胞RAGs mRNA 的表达和调节机制仍不清楚. 本研究以代表T细胞发育成熟阶段的人T细胞白血病细胞株Jurkat细胞为研究对象，检测其RAG1和RAG2 mRNA的共表达情况，探讨T细胞激活剂对Jurkat 细胞RAGs mRNA表达水平的影响，为研究外周T细胞的RAGs表达调节机制奠定基础.

    1材料和方法

    1.1材料Jurkat细胞株购自上海细胞生物研究所（clone E61, ATCC Number TIB152, TCRαβ+CD3+CD4+CD8CD2+CD7+). 分泌抗CD3 mAb的杂交瘤细胞株12F6由南方医科大学分子免疫学研究所冻存. RPIM 1640培养基（美国GIBCO 公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；植物血凝素(Phytohemagglutinin, PHA 广东医药研究所产品）；佛波醇12豆蔻酰13乙酸酯（Phorbol 12Myristate 13Acetate，PMA），钙离子载体A23187（美国Sigma 公司）；总RNA提取试剂盒（安徽优晶生物工程有限公司）；RNA逆转录试剂盒（日本TOYOBO公司）；Taq DNA聚合酶（立陶宛MBI Fermentas 公司）；pUCmT 载体（上海生工生物工程技术服务有限公司）；DL2000 DNA Marker（TaKaRa大连宝生物有限公司）.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养、处理及总RNA提取Jurkat细胞用含有100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基于37 ℃, 50 mL/L CO2条件下培养. 将对数生长期的Jurkat细胞，按1×109/L的密度培养于12孔板中，分别加入PHA（20 mg/L）,抗CD3 mAb（1∶100）, PMA（40 μg/L）+A23187（0.5 μmol/L），同时设不加任何处理因素的对照组，每组均设3个复孔，分别在培养的第6, 12 h ，收集各组细胞，PBS洗涤2~3次后采用试剂盒提取细胞总RNA，在核酸蛋白分析仪（BECKMAN DU530）上鉴定RNA纯度和浓度，-70℃冻存备用.

    1.2.2RNA逆转录取样品总RNA约1 μg，加到20 μL反应体系中按试剂盒说明进行逆转录.

    1.2.3PCR扩增RAG1, RAG2  mRNAPCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成. RAG1上下游引物序列分别为：5′GAGCAAGGTACCTCAGCCAG3′， 5′GAGGCATCTGAGAATGCAG 3′，扩增片段长度为984 bp，PCR反应条件为94℃ 2  min；94℃ 30 s, 58℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；RAG2上下游引物序列分别为：5′ATACCTGGTTTAGCGGCAAA3′, 5′CCAGCCTTTTTGTCCAAAGAA 3′， 扩增片段长度为192 bp，反应条件为94℃ 2 min；94℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 45 s，30个循环； βactin 上下游引物序列分别为：5′ACATTAAGGAGAAGCTGTGC3′, 5′CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT3′， 扩增片段长度375 bp.  βactin与RAG1或RAG2在同一反应体系中扩增. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后采用凝胶成像系统（BIORAD Gel Dox XR system）照相.

    1.2.4PCR产物的克隆和序列分析切胶回收并纯化PCR目的产物条带，将之与pUCmT载体连接后转化DH5α感受态菌，采用α互补实验挑选阳性克隆进行测序，DNA序列测定由大连宝生物工程有限公司完成.

    1.2.5RTPCR产物半定量分析将PCR产物电泳条带用全自动图像分析系统（德国KONTRON IBAS 2.0）分析，测出每一条带的面积（AREA）乘以平均光密度（mean optical density of the object, OPTDM），得出结合光密度（integrated optical density of the object, OPTDI)，根据RAG1和RAG2与βactin OPTDI的比值目的基因的相对表达量来进行半定量分析.

    统计学处理： 所得数据用x±s表示，应用SPSS 10.0统计软件对数据进行方差分析（Oneway ANOVA）和LSDt检验，P<0.05 为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1Jurkat细胞RAG1, RAG2 mRNA的表达在Jurkat细胞中同时检测到RAG1 和RAG2 mRNA 表达（图1）.

    1: RAG1;    2:  RAG2;  M: 核酸分子量标准DL2000.

    图1Jurkat细胞RAG1和RAG2  mRNA表达

    2.2T细胞激活剂对Jurkat 细胞RAGs mRNA表达的影响对照6, 12 h 组细胞RAG1, RAG2  mRNA表达量无显著性变化，而三种T细胞激活剂刺激诱导后RAG1  mRNA表达量明显低于对照组（P<0.05），以PMA+A23187组降低最为明显；同一处理因素作用12 h组的细胞RAG1 mRNA表达量都低于作用6 h组（P<0.05）；PHA作用组RAG2表达量均显著低于对照组（P<0.05），PMA+A23187处理组未检测出RAG2 mRNA的表达；而抗CD3 mAb处理组中，作用12 h组RAG2 mRNA表达量明显高于对照组（P<0.05，图2）.

    3讨论

    本实验发现，代表T细胞发育成熟阶段的Jurkat细胞同时表达RAG1和RAG2 mRNA，RTPCR产物测序结果表明与Gene Bank报道序列完全一致. Jurkat细胞经T细胞激活剂诱导后RAGs表达水平发生变化. 结果提示Jurkat细胞有发生TCR重排的可能，且其RAGs的表达可能经TCR信号传导通路调节. 进一步证实：已经具有功能性抗原受体的淋巴细胞也可表达RAGs ，即在某些情形下TCR的存在并不足以中止RAGs的表达. 

    A: RAG1与βactin; B: RAG2与βactin. 1,3,5,7: 分别是PHA，抗CD3 mAb, PMA+A23187和对照 6 h组;  2,4,6,8: 分别是相应各12 h组;   M: 核酸分子量标准DL2000.

    图2不同处理因素对RAG1, RAG2 mRNA 作用的RTPCR产物电泳图

    在体外用抗CD3抗体作用于小鼠胸腺皮质双阳性细胞引起TCRCD3复合体交联，或用PMA和钙离子载体处理小鼠胸腺皮质细胞和未成熟preT细胞株CCRFCEM后导致RAG1和RAG2表达下调，且PMA引起的RAGs表达下调作用更为迅速而显著［4-5］.  我们以PHA, PMA+A23187作用于成熟T细胞株Jurkat后RAGs基因表达亦呈下调趋势，尤以PMA+A23187作用最为明显. 但抗CD3 mAb作用组Jurkat细胞RAG1表达下调，而RAG2表达增加，与中枢或未成熟前T细胞株诱导后的变化有所不同，可能反映了中枢T细胞和前T细胞与外周T细胞在RAGs表达调节机制上的不同，有可能RAG2更多地参与了Jurkat细胞TCRCD3复合体的信号传导过程. 

    RAGs的表达和调节是一个高度复杂而有序的过程，RAG蛋白的正确时空特异性表达对获得性免疫系统的正常发育至关重要. 经典的免疫学理论认为，T细胞迁出胸腺后不再表达RAGs和发生重排. 但近年的研究表明，经重排形成的TCR在特定条件下还可发生再次重排，使其原有的抗原特异性改变或发生亲和力的变化，这种现象被称为受体编辑/修正［6-8］. 外周T淋巴细胞RAGs的表达调节和V(D)J重排机制与自身免疫病、肿瘤和免疫缺陷等疾病关系的研究已成为热点，国外一些实验室主要利用转基因动物模型技术进行研究. 基于本实验结果以及Jurkat细胞是代表T细胞发育成熟阶段的单克隆细胞株的特点，我们考虑可利用Jurkat细胞株建立一个研究外周成熟T淋巴细胞RAGs的表达调节和V(D)J重排的细胞模型，可弥补转基因动物模型研究成本和技术要求高等不足之处，便于我们在现有实验条件下开展此方面的研究.

    【】

    ［1］ Raul M, Frederick WA.  Receptor revision in T cell: an open question［J］? TRENDS Immunol, 2004,25:276-279.

    ［2］ Lantelme E, Mantovani S, Palermo B, et al. Increased frequency of RAGexpression, CD4+CD3low peripheral T lymphocytes in patients with defective responses to DNA damage［J］. Eur J Immunol, 2000,30:1520-1525.

    ［3］ Lantelme E, Palermo B, Granziero L, et al. RAG gene expression and V(D)J recombination in CD4+CD3low mature T lymphocytes［J］. J  Immunol, 2000,164:3455-3459.

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