海风藤酮治疗大鼠实验性急性胰腺炎
【关键词】 胰腺炎；血小板活化因子；海风藤酮；肿瘤坏死因子；白细胞介素
Role of kadsurenone in treatment of experimental acute pancreatitis in rats
【Abstract】 AIM: To explore the effect of kadsurenone on inflammatory mediators in rats during acute pancreatitis (AP). METHODS: A total of 104 SD male rats which weighed 250-300 g were randomly divided into sham group (n=24), AP group (n=40) and kadsurenone group (n=40). The animals in the groups were killed in 3, 6, 12, 24 h after operation for experimental observation. RESULTS: The serum levels of PAF, TNFα and IL6 of AP rats significantly increased （P<0.01）, and the serum level of TNFα got to a peak at 6h and the serum IL6 at 12 h after operation (P<0.01 vs sham group in each period of time). After kadsurenone was used in AP rats, the serum levels of PAF, TNFα and IL6 were significantly decreased （P<0.05）. CONCLUSION: Kadsurenone can inhibit inflammatory mediators and relieve the damages of the pancreas or lung in AP rats.
【Keywords】 pancreatitis; plateletactivating factor; kadsurenone; tumor necrosis factorα; IL6
【摘要】 目的：探讨海风藤酮对急性胰腺炎炎症介质的影响及其作用. 方法：雄性SD大鼠104只，质量250～300 g，随机分为假手术对照组（n=24），急性胰腺炎组(n=40)和海风藤酮治疗组(n=40)，每组又按3，6，12，24 h分为4小组. 结果：急性胰腺炎组各时段血清PAF，TNFα，IL6显著升高，其中PAF在各时相持续升高，TNFα在6 h时达高峰，而IL6在12 h达高峰，与假手术组各个时相段比较有显著性差异（P＜0.01）；用药后治疗组各个时相段可显著降低血清PAF，TNFα，IL6的水平（P＜0.05）. 结论：海风藤酮可抑制炎症介质，明显减轻胰腺/肺组织病理损害.
【关键词】 胰腺炎；血小板活化因子；海风藤酮；肿瘤坏死因子；白细胞介素6
0引言
急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是严重危害人类健康的急腹症，病死率高、发病机制复杂，有多种因素及炎性因子参与救治难度大. 细胞因子及炎性递质在AP的发生中起重要作用［1-2］. 海风藤酮（kadsurenone）是中药海风藤的提取物，我们研究海风藤酮对急性胰腺炎合并肺损伤大鼠炎症介质PAF，TNFα，IL6的影响，为探讨该药在临床上应用治疗AP的可能性提供理论和实验依据.
1材料和方法
1.1材料雄性SpraqueDawley（SD）大鼠104只，体质量250～300 g，购自西安大学实验动物中心. 实验动物实验前禁食12 h，自由进水. 海风藤酮（共150 mg） 购自北京大学药学院，牛磺胆酸钠购自Sigma公司，髓过氧化物酶（MPO）测定试剂盒 购自南京建成生物公司，PAF标准品购自Sigma公司，大鼠IL6 ELISA试剂盒 购自Sigma公司，大鼠TNFα ELISA试剂盒购自Sigma公司.
1.2方法采用随机数字把104只大鼠分为3组，分别为假手术对照组(n=24)，急性胰腺炎（AP）组(n=40)，海风藤酮治疗组(n=40)，每组又按术后3，6，12，24 h平均分为4个小组. 第1组大鼠术前12 h禁饮食，氯胺酮ip麻醉（1.5 mL/kg），仰卧固定，剪毛后常规消毒、铺巾，腹正中开腹，轻微刺激胰胆管后，关腹；第2组采用张群华等［3］的方法制备AP模型；第3组制模术后立即经阴茎静脉注入海风藤酮，每6 h，10 mg/kg， 1～2次. 由于海风藤酮均以DMSO(25 g/L)为溶剂，故假手术组及AP模型组均于术后经阴茎静脉注射等量的DMSO. 3组大鼠分别在术后3，6，12，24 h，氯胺酮ip麻醉（1.5 mL/kg），仰卧固定，剪毛常规消毒、铺巾，开腹. 经下腔静脉抽血4～8 mL，不加抗凝剂，凝血后离心（3000 r/min，18℃，10 min），取血清1.5～3 mL (-80℃)保存，留待进行生物法检测血小板活化因子、ELISA检测TNFα及IL6及全自动生化仪检测血清淀粉酶. 同步取胰腺组织和肺组织，部分制成组织匀浆，测定髓过氧化物酶（MPO）的活性，部分用Bouin液固定，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察胰腺及肺的炎症病理变化.
统计学处理： 采用SPSS 12.0 for Windows软件包进行统计分析，实验数据以x±s表示；组间比较用非参数秩和检验， P＜0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1血清淀粉酶活性AP组血清淀粉酶显著升高，到12 h时达高峰，与假手术组相比较有统计学差异（P＜0.01）；治疗组与AP组各时相段比较可降低血清淀粉酶，差异有统计学意义（P＜0.05），但仍高于假手术组各时相段（P＜0.05，表1）.
表1AP大鼠血清淀粉酶浓度的变化（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs AP.
2.2胰肺组织MPO活性采用单因素方差分析：假手术组各时相段胰腺及肺组织MPO活性相比较无统计学差异（P＞0.05）；注射35 g/L牛磺胆酸后，AP组、组胰腺及肺组织MPO活性显著升高，到12 h时达高峰，与假手术组相比较有统计学差异（P＜0.01）；给药后3，6，12及24 h时，海风藤酮治疗组与AP组组间比较差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）. 说明海风藤酮可显著降低胰腺及肺组织MPO活性（表2）.
表2AP大鼠胰腺及肺组织MPO活性的变化（略）
aP<0.05 vs AP.
2.3血清PAF，TNFα，IL6AP组各时段血清PAF，TNFα，IL6升高，其中PAF持续升高，TNFα在6 h时达高峰，而IL6在12h达高峰，与假手术组各个时相段比较有统计学差异（P＜0.01）；用药后治疗组与AP组比较各个时相段可降低血清PAF，TNFα，IL6的水平（P＜0.05，表3）.
表3血清中PAF,TNFα,IL6的变化（略）
aP<0.05 vs AP.
2.4胰肺病理组织学假手术组大鼠胰腺/肺组织未见明显病理改变. AP组3 h后胰腺水肿加重，于12 h达高峰，腺泡呈孤岛样分布，片状出血坏死，大量PMN浸润；6，12 h肺以PMN增多为主，肺泡间隔增厚，可见少量红色蛋白渗出物，并可见肺泡壁破裂，肺间质充血、水肿、明显增宽，肺泡和肺间质中有大量的中性粒细胞浸润. 用药后，可显著减轻胰腺/肺组织的病理损害，炎性细胞浸润减少，水肿、出血、坏死减轻，表现为点状坏死.
3讨论
AP发病机制十分复杂，早期胰腺细胞损伤导致局部的炎症反应，随着疾病进展，就会引起全身炎症反应综合征（STRS）严重时可出现多脏器功能不全（MODS）甚至多脏器功能衰竭（MOF），病死率常高达40%［4-5］. 胰腺腺泡损伤后，释放多种受激活的胰酶及炎症细胞因子，有多种细胞的过度激活和相互作用，产生氧自由基和炎症介质引起胰腺的血管通透性增加，最后导致了胰腺炎的发生. 目前研究表明，重症急性胰腺炎相关肺损伤也与胰酶异常激活和释放、炎性细胞过度激活、炎症介质的释放致个身STRS等有关［6］. 我们证实注射牛磺胆酸后，AP组各时段血清PAF显著持续升高，到24 h时达高峰，与假手术组对应时相段比较有统计学差异（P＜0.01），假手术组各个时相段血清PAF相比较无统计学差异（P＞0.05）. 提示PAF和其他的炎性细胞因子（如TNFα,IL6）一起在AP中起着重要作用. 治疗组与AP组相应时相段比较有统计学差异（P＜0.01），说明海风藤酮能够抑制血清PAF,TNFα及IL6的水平. 相关性也表明血清PAF变化与胰腺组织MPO活性、胰腺组织形态学改变呈正相关；血清PAF变化与肺组织MPO活性、肺组织形态学改变呈正相关. PAF拮抗剂海风藤酮治疗AP的主要作用机制可能有［7-8］：①与PAF竞争靶位，抑制PAF活性的发挥；②抑制AP血中PAF含量的升高；③抑制巨噬细胞、淋巴细胞及内皮细胞产生TNFα,IL6,IL8等炎性细胞因子和炎性递质；④抑制中性粒细胞活性，降低髓过氧化酶；⑤减低血管通透性，提高微循环的血流速度；⑥降低胰酶活性，减轻胰腺组织自我消化等作用机制.
PAF是通过多种效应、多个环节参与AP的发生，已日益受到关注，而且阻断PAF治 疗AP的研究也取得了可喜的成绩，本实验应用特异性PAF抑制剂海风藤酮来治疗AP，是第一次系统的在炎症介质水平上了解海风藤酮对AP的影响. 目前尚未见临床报道，为阐明AP的发病机制和治疗AP提供了理论和实验依据.
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