红景天与葛根水提取物对微粒体LPO模型的影响
【关键词】 红景天；葛根；抗氧化；脂质过氧化；氧电极
Effects of Rhodiola and Pueraria on peroxidative damage model in microsome
【Abstract】 AIM: To investigate the antioxidative action of the water extracts of Rhodiola and Pueraria, and the doseeffect relationship. METHODS: SpragueDawley rats were killed and then the livers were removed to prepare homogenate and isolate the microsome by calcium ion precipitation. The water extracts of Rhodiola and Pueraria were extracted by decocting. Three lipid peroxidation models were induced by Vc/Fe2+,CHP and NADPHADP/Fe2+. The 2 different extracts were added into the 3 models respectively to obtain the final concentrations of 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 mg/mL. Then the contents of malondialdehyde (MDA) were examined for analyzing the antioxidative action of extracts in the Vc/Fe2+, CHP stimulated models. Oxygraph electrode was used to determine the inhibition rate of oxygen uptake in NADPHADP/Fe2+ model. RESULTS: In Vc/Fe2+ model, the 2 extracts showed the highest inhibition rate at the concentration of 6.25 mg/mL. In the CHP model, the content of MDA in groups with 3.13 to 25 mg/mL of Pueraria extract decreased significantly （P<0.05）. In NADPHADP/Fe2+ model, the highest inhibition rates of the Rhodiola and Pueraria water extracts reached 43.07% and 75.09%. CONCLUSION: The 2 water extracts have good antioxidative effects. The Pueraria water extract has a comparatively stronger effect in the models in the presence of enzymes, conversely, Rhodiola water extract has a stronger effect in the models in the absence of enzymes.
【Keywords】 rhodiola； pueraria; antioxidative; lipid peroxidation; electrode oxygraph
【摘要】 目的：探讨红景天与葛根水提物的抗氧化作用及其剂量反应关系. 方法：煎煮法制备红景天和葛根水提物. 钙沉淀法提取雄性SD大鼠肝微粒体. 采用三种激发剂Vc/Fe2+,CHP和 NADPHADP/Fe2+建立微粒体脂质过氧化（LPO）模型，加入不同浓度的红景天、葛根的水提物，观察两种中药的抗氧化作用. 在Vc/Fe2+，CHP模型中通过比色法测定对丙二醛的抑制作用，NADPHADP/Fe2+模型通过氧电极法测定对耗氧量的抑制作用. 结果：在Vc/Fe2+模型中，两者在浓度为6.25 mg/mL时有最大抑制率. 在CHP模型中，葛根水提物在3.13～25 mg/mL范围内其MDA含量低于对照组（P<0.05）. 在NADPHADP/Fe2+模型中，红景天、葛根水提物的抑制率分别达到43.07％和75.09％. 结论：两种中药的水提取物都具有较强的抗氧化作用，并存在一定的剂量效应关系. 其中葛根水提物对酶参与性反应的抑制作用强于红景天水提物，而在非酶参与性反应中，红景天水提物的作用更强. 研究结果为两种中药在自由基损伤保护作用的机制提供了实验依据.
【关键词】 红景天；葛根；抗氧化；脂质过氧化；氧电极
0引言
随着自由基医学的不断，人们逐渐意识到自由基在人类多种疾病的发生发展过程中扮演着重要的角色. 与此同时，寻找有效、无毒副作用的自由基清除剂也成为人们关注的问题. 其中具有生物学活性的自由基清除剂筛选模型，包括Vc/Fe2+,过氧基异丙苯（CHP）和四氯化碳（CCl4）的刺激模型被成功应用，尤其是在中药提取物的抗氧化活性的测定中发挥了重要作用. 本实验提取了红景天、葛根的水提物，应用多种微粒体抗氧化剂筛选模型研究两种提取物的抗氧化剂量反应关系.
1材料和方法
1.1材料二级雄性SD大鼠20只，体质量180～200 g，第四军医大学实验动物中心提供. 硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA），CHP,NADPH,ADP均为Sigma产品； MDA标准品为Merck产品；考马斯亮蓝，牛血清白蛋白为华美试剂公司产品；其他化学试剂均为AR试剂；3K30型台式高速冷冻离心机（Sigma）；CY2型测氧仪及氧电极(上海新华仪器厂)；501型超级恒温器(重庆实验设备厂)；722型光栅分光光度计（山东高密分析仪器厂），台式自动平衡记录仪(上海大华仪表厂). 大花红景天、葛根一级品，各500 g，购于西安万寿路药材市场.
1.2方法
1.2.1微粒体及提取物的制备钙沉淀法制备大鼠肝脏微粒体［1］. 采用煎煮法制备红景天、葛根水提物［2］. 取中药材，加入8倍重量的水煎煮1.5 h后，过滤，药渣再经5倍重量水煎煮1 h，得水提液. 得到水提液趁热过滤，过滤液继续加热，蒸发掉水分得到水提稠膏经80℃烘干，备用，检测水分小于5%. 置于干燥器内保存.
1.2.2微粒体Vc/Fe2+脂质过氧化激发模型采用本科室的常规方法. 反应体系中的基本缓冲液为Tris／HCl (0.1 mol/L，pH=7.4)与KCl（0.15 mol/L）按1∶2比例混合配制. 700 mL/L乙醇溶解红景天提取干粉，制成5个剂量组，浓度为25，12.5，6.25，3.13，1.56 mg/mL. 每组3个平行样. 同时，设空白对照及阳性对照（用蒸馏水替代红景天提取物，阳性对照设3个平行样）. 反应体系中含缓冲液0.8 mL，50 μmol/L FeSO4 0.15 mL，5 mmol/L抗坏血酸0.15 mL，微粒体悬液和不同浓度的提取物各0.2 mL，37℃水浴15 min，100 g/L三氯醋酸3.0 mL终止反应，3000 r／min离心10 min，取上清2 mL加入2 mL 6.7 g/L TBA，100℃水浴15 min，流水冷却，以空白对照调“零”，E535 nm比色，读取OD值. 同时用不同浓度的MDA标准品作标准曲线，拟合标准直线方程，由此各组的MDA含量.
1.2.3微粒体CHP脂质过氧化激发模型缓冲液的配制、分组及步骤同1.2.2. 反应体系中含缓冲液1 mL, 1 mmol/L CHP 0.15 mL，微粒体悬液0.2 mL和不同剂量的提取物0.15 mL.
1.2.4微粒体NADPHADP/Fe2+体系中耗氧量氧电极法的测定［3-4］，采用CY2型测氧仪及氧电极连接台式自动平衡记录仪，自制3 mL反应池，循环水温度37℃，磁力搅拌速度恒定在60 r/min，灵敏度1/8. 反应体系：NADPH: 0.0375 μmol/L； ADP: 0.927 μmol/L；Fe2+: 9.375 μmol/L；微粒体0.365 mg protein/mL（以上浓度均为终浓度），用基本缓冲液补足3 mL. 设3个剂量组，每组设3个平行样.
1.2.5耗氧量及抑制率的计算［5］MDA生成抑制率（％）＝（阳性对照MDA-样品MDA）/阳性对照MDA×100；耗氧量（μmol/g・min）＝241(μmol/L)×斜率(mm/min)/ 扩展（mm）×蛋白浓度（g/L）；耗氧抑制率（％）＝（阳性对照耗氧量-样品耗氧量）/阳性对照耗氧量×100.
统计学处理：所有数据用x±s表示，数据处理采用SPSS 11.5统计分析软件进行，浓度与抑制率之间的关系采用线性回归分析. 多组间比较采用KruskalWallis H检验，两两比较采用Wilcoxon秩和检验. P<0.05认为有统计学差异.
2结果
2.1Vc/Fe2+激发的LPO模型与阳性对照组相比，红景天、葛根提取物各给药浓度下MDA含量显著降低（P<0.01），分别在12.5和3.13 mg/mL浓度下有最大抑制率. 红景天组在各个给药浓度下其MDA抑制率均显著高于葛根组(P<0.05，表1).
表1红景天、葛根提取物对Vc/Fe2+，CHP，NADPHADP/Fe2+激发的LPO模型的影响(略)
aP<0.05, bP<0.01 vs阳性对照； cP<0.05,dP<0.01 红景天vs葛根.
2.2CHP激发的LPO模型与阳性对照组相比，红景天、葛根提取物各给药浓度下MDA含量显著降低（P<0.05），葛根组（P<0.01），分别在1.56和25 mg/mL浓度下有最大抑制率. 红景天组在两个较低给药浓度下其MDA抑制率显著高于葛根组（P<0.05），而其他三个浓度下均显著低于葛根组（P<0.05）. 其各给药浓度与抑制率之间的决定系数R2分别为0.6073和0.9799（表1）.
2.3NADPHADP/Fe2+激发的LPO模型在1.56, 6.25, 25 mg/mL三个给药浓度下两种提取物对NADPHADP/Fe2+激发的LPO模型的耗氧量抑制率均显著低于对照组. 红景天组在两个较低给药浓度下其耗氧量抑制率显著低于葛根组（P<0.05）. 其各给药浓度与抑制率之间的决定系数R2分别为0.9723和0.9994（表1）.
3讨论
红景天(Rhodiola)和葛根（Puerariaa）是两种富含黄酮类［5］和异黄酮类的中草药. 它们作为抗氧化剂应用在多种疾病的与预防中［6-7］. 目前的研究多为针对两者的活性成分单体如红景天苷、百脉根苷［8］和葛根素［9］进行抗氧化作用研究. 但是，由于自由基反应具有链式的特性，而使单一的抗氧化剂在体内体外实验中都无法达到预期的效果. 另外，筛选和测定抗氧化活性也受到试验模型的限制. 整体实验不能说明具体机制，化学反应又不代表生物体系的实际情况，本研究采用微粒体脂质过氧化模型，不仅能观察到被测物质在生物体内的反应性，量效关系，而且还能知道具体的反应机制. 因此具有明显的优点. 本实验主要针对红景天和葛根水提物在体外微粒体脂质过氧化模型中的反应性，测定抗氧化作用的活性强度，以及剂量效应关系，为进一步探讨其药理作用及联合应用提供实验与理论依据.
微粒体是细胞内质网的碎片，含有混合功能氧化酶系统包括细胞色素氧化酶P450(CYP450)，黄嘌呤氧化酶等多种同功酶，参与内源性和外源性化合物代谢. 生物体在需氧代谢过程中的氧化还原反应伴有超氧阴离子自由基、羟自由基等生成，可以引发生物膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应从而导致一些疾病（衰老、心血管病、炎症、肿瘤等）的发生，因而研究中药有效成分的抗氧化作用对预防、治疗这些疾病可能发挥重要作用.
本研究采用的三种微粒体LPO模型分别代表了不同的激发体系，Vc/Fe2+，CHP激发体系代表非酶参与性反应，其中Vc/Fe2+代表无机物激发剂，CHP代表有机物激发剂；NADPHADP／Fe2+代表酶参与性反应，此体系中包括黄嘌呤氧化酶，NADPH脱氢酶等酶促反应. 维生素C与二价金属离子，通过Fenton反应，生成超氧阴离子自由基和羟自由基.
脂质过氧化反应的结果是自由基攻击多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFA）裂解生成MDA等终产物，同时伴随氧的消耗.
因此测定脂质过氧化终产物MDA或耗氧量的变化能较好地反映脂质过氧化的水平. 结果表明，红景天和葛根水提物对三种LPO模型都有一定的抑制作用. 两种提取物虽然对非酶与酶参与性反应均有较强作用，但是作用机制并不相同. 与葛根提取物相比，红景天能更好的清除超氧阴离子自由基和羟自由基. 但是在CHP模型中，虽然两者的最高抑制率接近，但是葛根有较好的剂量反应关系. 但是，葛根对耗氧量的抑制作用要强于红景天，表明葛根对NADPH参与的酶参与性反应有较强的作用，NADPH是微粒体LPO链式反应的必需环节［10］：NADPH→FP→CytP450→Fe2+→R→LPO的启动环节，推断葛根水提物的抗氧化作用机制在于抑制了NADPH氧化酶的活性. 实验结果表明，红景天和葛根都是有效的抗氧化剂，联合应用于抗自由基损伤疾病中，可能会有好的疗效. 实验再一次证明应用微粒体脂质过氧化模型是筛选抗氧化剂的可靠的技术平台.
【】
［1］ Kim HJ, Chang EJ, Cho SH,et al. Antioxidative activity of resveratrol and its derivatives isolated from seeds of Paeonia lactiflora［J］. Biosci Biotechnol Biochem, 2002,66(9): 1990-1993.
［2］ 李仪奎,王钦茂，周金黄，等.中药药理实验方法学［M］.上海：上海技术出版社, 1991：36.
［3］ 张文清，海春旭，龚书明. 锌对大鼠肝微粒体脂质过氧化模型抗氧化作用的实验研究［J］. 解放军预防医学杂志，1998，16（4）：250-254.
［4］ 海春旭,张文清. 微粒体NADPHADP/Fe2+体系中耗氧量氧电极法的测定及铁、铜、锌对耗氧量的影响［J］. 第四军医大学学报，1992,13（3）：194-196.
［5］ Akgul Y, Ferreira D, Abourashed EA,et al. Lotaustralin from Rhodiola rosea roots［J］. Fitoterapia,2004,75(6):612-614.
［6］ Xu ME, Xiao SZ, Sun YH, et al. The study of antimetabolic syndrome effect of Puerarian in vitro［J］. Life Sci, 2005,4(25):3183-3196.
［7］ Bo J, Ming BY, Gang LZ, et al. Protection by Puerarian against MPP+induced neurotoxicity in PC12 cells mediated by inhibiting mitochondrial dysfunction and caspase3like activation［J］.Neurosci Res,2005,53(2):183-188.
［8］ Wang Q, Ruan X, Jin ZH, et al. Identification of Rhodiola species by using RPHPLC［J］. J Zhejiang Univ Sci, 2005, 6(6):477-482.
［9］ Jiang RW, Lau KM, Lam HM, et al. A comparative study on aqueous root extracts of Pueraria thomsonii and Pueraria lobata by antioxidant assay and HPLC fingerprint analysis［J］. J Ethnopharmacol， 2005, 96(12):133-138.
［10］ Matthias A, Gillam EM, Penman KG,et al. Cytochrome P450 enzymemediated degradation of Echinacea alkylamides in human liver microsomes［J］. Chem Biol Interact, 2005, 155(12):62-70.
