单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的基因扩增、克隆及其B细胞抗原表位分析

            作者：王茜，曾抗，孙乐栋，周再高，刘凤岩

【关键词】  单纯疱疹病毒2型；包膜糖蛋白G

　　Gene cloning and B cell antigen epitope analysis of HSV2 glycoprotein G

　　【Abstract】 AIM: To clone fulllength glycoprotein G (gG2) gene of herpes simplex virus type Ⅱ(HSV2) and make a forecast to B cell antigen epitope of gG2. METHODS: The gG2 gene of HSV2 amplified by PCR was inserted into   pGEMT carrier, then transected into E.coli DH5α cells for sequencing. Then, B cell antigen epitope was analyzed  by Lasergene, Clustal X softwares. RESULTS: We have cloned fulllength gG2 gene of HSV2. By making an analysis to B cell epitope of gG2, we found that the homology in Nterminal of gG1 and gG2 genes of HSV was very low. B cell antigen epitope of gG2 of HSV2 showed a very high antigen index in "peculiarity domain". CONCLUSION: The successful cloning of fulllength gG2 of HSV2 and a successful forecast to B cell epitope of gG2 provide evidences and references for developing diagnostic kits for herpes virus infection and finding better target sites of HSV2 vaccine.

　　【Keywords】 herpes simplex virus type Ⅱ; glycoprotein G2; genes cloning; epitope

　　【摘要】 目的：克隆单纯疱疹病毒2型（HSV2）糖蛋白G2(gG2)全长基因并对糖蛋白G2进行B细胞抗原表位预测. 方法：用PCR法扩增HSV2的gG2基因，连接到pGEMT载体，转化大肠杆菌DH5α株后测序. 利用Lasergene，Clustal X等软件，进行B细胞抗原表位预测. 结果：完成单纯疱疹病毒2型（HSV2）gG2全长基因克隆. 通过B细胞抗原表位分析，发现HSV1的gG1和HSV2的gG2氨基端的同源性很低. gG2蛋白在“独特区”存在抗原指数非常强的抗原表位. 结论：成功构建单纯疱疹病毒2型（HSV2）gG2全长基因克隆，为单纯疱疹病毒感染的诊断试剂的研发及抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供研究材料和.

　　【关键词】 单纯疱疹病毒2型；包膜糖蛋白G2；基因克隆；抗原表位

　　0引言

　　单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是引起人类病毒性疾病中常见的病毒之一，可分为HSV1和HSV2两种血清型. HSV2型主要感染外生殖器和躯干下部皮肤，引起生殖器疱疹、新生儿疱疹. 目前认为与生殖器恶性肿瘤相关，并增加了AIDS的感染机会［1］. HSV2病毒颗粒中至少有11种包膜糖蛋白，其中gG2为型特异性抗原［2］，在单纯疱疹2型病毒诊断、分型和疫苗研究中起到重要作用. 我们对HSV2 的gG2基因进行克隆，并利用生物信息学软件对gG2基因进行B细胞抗原表位分析，为gG2蛋白作为诊断试剂和疫苗研究打下基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料HSV2病毒株由本课题组在广东地区单纯疱疹感染患者中分离培养并感染于Vero细胞中保存，Vero细胞、DH5α细胞由本实验室保存. DNAzsolE， DNA纯化试剂盒购自申能博彩公司，ExTaq酶、dNTP购自TaKaRa公司，pGEMT载体购自Promega公司.

　　1.2方法

　　1.2.1引物设计根据GenBank提供的HSV2病毒（Genbank access number: Z86009）基因组全序列，利用LasergenePrimerSelect软件设计引物. 上游的引物序列是5′AAGCTTACCTTGCCGCCCGGCGTCA3′；下游的引物序列是5′GCGGCCGCTTATCGTGGACATTTGGTCG3′. 引物由上海博亚生物技术有限公司合成.

　　1.2.2DNA提取采用DNAzsolE从HSV2病毒Vero细胞培养上清中提取DNA.

　　1.2.3gG2基因的扩增使用TaKaRa公司ExTaq酶进行PCR. 反应液包括：2.5 mmol的dNTPs 3 μL，10×PCR buffer 3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ExTaq 0.5 μL，cDNA模板5 μL，H2O 16.5 μL，总体积30 μL. 反应条件：94℃，2 min；94℃，30 s，55℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃ 8 min，4℃保存.

　　1.2.4基因克隆使用申能博采公司DNA纯化试剂盒回收PCR产物，将回收产物与pGEMT载体连接， 4℃放置12 h. 将重组载体转化DH5α感受态细胞，于氨苄青霉素抗性固体LB培养基上37℃培养16 h，利用XGal和IPTG筛选阳性重组克隆. 获得的阳性克隆菌扩大培养，提取质粒分别经PCR和双酶切初步鉴定，送TaKaRa公司测序.  利用protean软件对HSV2病毒gG2基因以及HSV1病毒gG1基因进行B细胞抗原表位分析，并比较这两型单纯疱疹病毒糖蛋白G之间的异同.

　　2结果

　　2.1HSV2病毒gG2基因扩增结果取确诊生殖器疱疹病毒感染者分泌物接种Vero细胞，约6 d发生病变后，取上清提取DNA，用设计的引物进行PCR，经7 g/L琼脂糖凝胶电泳可见一约2191 bp的片段，与HSV2标准株的gG2基因大小一致（图1）. 将上述PCR产物纯化回收后（图1），与pGEMT载体连接，转化DH5α感受态细胞，利用蓝白斑菌落筛选阳性重组克隆. 对阳性克隆扩大培养，提取质粒进行PCR和双酶切初步鉴定，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳条带大小约2191 bp，阳性克隆质粒双酶切后电泳出现两条带， 一条大小约2191 bp，另一条大小位于3000 bp（图2），与预期结果完全一致.

　　M: DNA Marker, DL15000；1：HSV2的gG2基因PCR扩增产物；2：纯化的gG2基因；3：DNA Marker DL2000.

　　图1扩增的HSV2 gG2基因的电泳（略）

　　2.2序列测定及B细胞抗原表位鉴定后的阳性克隆进行序列分析发现，阳性克隆质粒中gG2基因测序结果与GenBank际标准株序列同源性有99.52％. 将基因序列翻译成氨基酸序列，根据序列分析结果，采用PolyKyteDoolittl亲水性、PoltEmini表面可能性、JamesonWolf抗原指数三参数综合预测方案预测，结果表明， HSV2病毒gG2蛋白中存在7段抗原指数以及表面可能性强的肽段相对集中区域. 分别是50~74, 134~160, 285~410, 437~482, 523~605, 615~637, 678~688，其中314~338, 352~367, 447~482, 527~544, 550~562, 570~578, 585~600, 615~625, 678~688肽段为最有代表性的肽段（图3,4）.

　　M: DNA Marker DL15000； 1：pGEMT载体gG2基因重组质粒结果；2：pGEMT载体gG2基因重组质粒HindⅢ单酶切结果；3：pGEMT载体gG2基因重组质粒HindⅢ/Not I双酶切结果.

　　图2HSV2 gG2基因重组克隆的鉴定（略）

　　图3HSV2 gG2蛋白B细胞表位分析（略）

　　图4HSV2和HSV1 gG2蛋白B细胞表位比较分析（略）

　　3讨论

　　HSV2包膜糖蛋白gG2由US4基因编码699个密码子，包括一个与HSV1包膜糖蛋白gG1基因高度同源的区域和一个“独特区”［3］. 通过对gG1蛋白和gG2蛋白的比对以及B细胞抗原表位的预测我们发现，gG1和gG2基因在“独特区”中的同源性非常低（图4）. gG2蛋白中存在7段抗原指数以及表面可能性强的肽段相对集中区域. 分别是50~74, 134~160, 285~410, 437~482, 523~605, 615~637, 678~688，其中314~338, 352~367, 447~482, 527~544, 550~562, 570~578, 585~600, 615~625, 678~688肽段为最有代表性的肽段. Grabowska等［4］利用噬菌体展示技术发现，两个位于gG2“独特区”内的免疫显位在氨基酸残基的351~427, 525~587内，并通过试验证明这两段氨基酸残基只与HSV2型单纯疱疹病毒反应而不与HSV1型单纯疱疹病毒反应. Ikoma等［5］利用杆状病毒表达系统表达gG2（281aa594aa），检测HSV2型感染患者血清特异性抗体，特异性和敏感性达到95.5％. 由此说明这两段区域的肽段适合用于临床抗体检测，尤其适合用于HSV2分型诊断. Liljeqvist等［6］研究发现［6］，HSV2的gG2基因序列抗原区域极少突变，即使出现了点突变也不会削弱gG2的血清学活性. 同时进一步证实gG2基因可以作为型特异性抗原，同时指出gG2基因的保守性是作为HSV2特异疫苗成分的先决条件.

　　我们成功扩增和克隆了HSV2型gG2全长基因片段，并通过B细胞抗原表位预测出gG1和gG2蛋白的同源性区域在gG1蛋白157~239肽段和gG2蛋白615~699肽段，其同源性达到70％以上，是HSV病毒高度保守的区域. 在HSV2的gG2蛋白的“独特区”存在7段抗原指数很强的氨基酸区段. 本研究为单纯疱疹病毒2型感染的诊断试剂的研发，抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供.

　　【参考】

　　［1］ 孙乐栋,周再高,曾抗,等. 性乱人群中单纯疱疹2型病毒感染情况及丽珠威的疗效观察［J］. 第一军医大学学报,2001，21（10）：769.

　　［2］ 周建勋. 单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV2）包膜糖蛋白G2相关研究进展［J］. 国外医学病毒学分册, 2004,11(4)：123-126.

　　［3］ Gorander S, Svennerholm B, Liljeqvist JA, et al. Secreted portion of glycoprotein G of herpes simplex virus type 2 is a novel antigen for typediseriminating serology［J］. J Clin Microbiol, 2003， 41(8): 3681-3686.

　　［4］ Grabowska A, Jameson C, Laing P, et al. Identification of type specific do mains within glycoprotein G of herpes simplex virus type 2 (HSV2) recognized by the majority of patients infected with HSV2, but not by those infected with HSV1 ［J］. Gen Virol, 1999,80(7):1789-1798.

　　［5］ Ikoma M, Liljeqvist J A, Groen J, et al. Use of a fragment of glycoprotein G2 produced in the baculovirus expression system for detecting herpes simplex virus type2 specific antibodies［J］. Clin Microbiol, 2002, 40(7): 2526-2532.

　　［6］ Liljeqvist JA， Syennerholm B， Bergstrom T, et al. T Conservation of type2 specific B2 cell epitopes of glycoprotein G in clinical herpes simplex virus type 2 isolates［J］. J Clin Microbiol, 2000, 38(12): 4517-4522.