大黄对幼鼠肝内胆汁淤积的治疗作用

【关键词】  大黄；胆汁淤积；动物模型；作用

　　Therapeutic effect of rhubarb on intrahepatic cholestasis in infant rats

　　【Abstract】 AIM: To explore the therapeutic effect of rhubarb on intrahepatic cholestasis in infant rats. METHODS: 90 SD infant rats were randomly divided into 5 groups: treatment group of  rhubarb, untreated group, treatment  control group 1 of UDCA (Ursodeoxychlic Acid, UDCA), treatment control group 2 of UDCA and deltasone, and blank control group not treated with αNaphthyl isothiocyanate (ANIT) or any other treatment. Jaundice model of intrahepatic cholestasis was established in infant rats by ANIT. At the time of the 2nd, 3rd, and 4th week, the concentrations of serum TB, DB, ALT, ALP and TBA were assessed by automatic biochemical analyzer. The histopathological changes of liver were observed respectively by light microscope and electron microscope. RESULTS: The concentrations of serum TB and DB were increased in the untreated group as compared with the blank control group, and there were significant differences in the concentrations of serum ALT, ALP and TBA between the untreated group and the blank control group （P<0.05） as well, which demonstrated that the animal model of hepatic jaundice with cholestasis was successfully established. The concentrations of serum DB, TB, ALP, ALT and TBA were significantly lower in the treatment group of rhubarb as compared with the untreated group (P<0.05). Meanwhile, better effects of relieving the jaundice and decreasing the ALP and TBA levels could be observed in rhubarb treatment group as compared with the UDCA group or treatment group of combined use of UDCA and deltasone. Only mild histopathological change in liver could be seen in rhubarb treatment group by light microscope or electron microscope as compared with the rats in other groups. CONCLUSION: Rhubarb remarkably reduces the concentrations of serum TB, DB, ALT, ALP and TBA, relieves the toxicity of bile acid and inhibits the hepatic injury or fibrosis.

　　【Keywords】 rhubarb; cholestasis; animal model; therapeutic effects

　　【摘要】 目的：探讨中药大黄对幼鼠肝内胆汁淤积的治疗作用. 方法： SD幼鼠90只随机分成大黄治疗组、未治疗组、UDCA组（熊去氧胆酸,UDCA）、UDCA＋D组(熊去氧胆酸联合强的松)、空白对照组；用α萘异硫氰酸酯（ANIT）灌胃建立幼鼠胆汁淤积性黄疸模型，检测在不同时间段血清TB, DB, ALT, ALP和TBA浓度；制作肝组织标本，进行光镜、电镜组织病观察. 结果：未治疗组与空白对照组比较，TB和DB均有数十倍的增高. 同时未治疗组血清ALT, ALP, TBA浓度与空白对照组比较也有显著性差异（P<0.05），表明成功构建幼鼠胆汁淤积性黄疸模型. 大黄治疗组的血清TB, DB, ALT, ALP及TBA值明显低于未治疗组（P<0.05），与治疗对照组比较，中药大黄在退黄、降低ALP, TBA方面优于UDCA和UDCA+强的松；光镜、电镜下大黄治疗组与未治疗组、治疗对照组比较，肝组织病理改变轻微. 结论：大黄能明显降低血清中TB, DB, ALT, ALP及TBA浓度，显著降低胆汁酸的毒性作用，抑制肝纤维化.

　　【关键词】 大黄；胆汁淤积；动物模型；治疗作用

　　0引言

　　肝内胆汁淤积的治疗目前尚缺乏有效方法，尤其在婴幼儿［1-2］. 利胆药熊去氧胆酸和中药大黄近年来日益受到广大学者的重视［3］. 大黄为传统常用中药，有多种药用价值，单味大黄广泛用于各科疾病的治疗，尤其是临床肝胆疾病的治疗，但多数为初步的临床疗效观察，缺乏对其作用机制的深入探讨，而且将大黄用于幼龄鼠进行疗效观察及作用机制的探讨，国内少有报道. 我们探讨大黄对幼鼠肝内胆汁淤积的治疗效果，为大黄治疗肝内胆汁淤积提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1．1材料健康SpragueDawley(SD)大鼠90只（第三军医大学大坪实验动物中心提供），雌雄各半，2周龄（由母鼠哺乳至3 wk龄分窝），体质量22~28 g. 日立7600生化自动检测仪；日本岛津公司紫外分光光度计UV1700；α萘异硫氰酸酯（ANIT）（Sigma公司）熊去氧胆酸胶囊250 mg/粒（德国福克大药厂生产）；丙二醛(MDA)测定试剂盒、总抗氧化能力(TAOC)试剂盒、一氧化氮(NO)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供. 2周龄幼鼠（相当于人婴幼儿期 ）90只随机分为空白对照组、未治疗组、大黄治疗组、UDCA组、UDCA＋D组，共5组，每组各18只，于实验2，3，4 wk分别取6只幼鼠进行血清和肝组织的检测.

　　1．2方法大黄治疗组、治疗对照组和未治疗组均给予20 g/L ANIT花生油溶液灌胃诱导肝损伤［4］，剂量60 mg/kg，隔日1次，连续用药4 wk. 给予ANIT灌胃3次（即6 d后），UDCA组、UDCA＋D组和大黄治疗组全程另分别给予熊去氧胆酸（UDCA）、UDCA+强的松、大黄煎液灌胃，1次/d. UDCA、强的松、大黄剂量按人与动物等效剂量折算公式［5］幼鼠用量(mg/kg) =（人用量）×21（人转换因子）/4.5（大白鼠转换因子），得每日剂量分别为50 mg/kg， 7.5 mg/kg和2.3 g/kg.  空白对照组为同期正常喂养大鼠. 将UDCA 50 mg, 强的松片剂7.5 mg研磨成粉溶于30 mL生理盐水中，充分混匀，制成混悬液，小鼠按30 μL/g灌胃；取生大黄2.3 g，洗净后放入30 mL沸水中，加盖密闭，浸泡20 min，过滤，取上清，小鼠按30 μL/g灌胃. 经以上措施处理2, 3, 4 wk后，所有被观察大鼠均以乙醚吸入麻醉后剪开右颈部暴露颈静脉，剪断颈静脉取血2~3 mL，静置2 h后(2000 r/min)离心，移液器分离血清. 立即取肝脏左叶组织4~6小块， 40 g/L甲醛缓冲液室温下固定,24 h后制备标本，用于光镜观察；25 g/L戊二醛固定（4℃冰箱保存），4 h后制备标本，组织经酒精、丙酮逐级脱水，环氧树脂618#包埋，光镜下定位，制备60 nm的超薄切片，采用H600透射电镜观察. 取血清0.5 mL立即送检测TB, DB, ALT, ALP和TBA浓度. 用日立7600生化自动检测仪检测，移液器将0.5 mL血清移入加样管中，系统自动取样分析，获取结果. 常规石蜡包埋切片，HE染色，中性树脂封片，光镜检查. 着重观察有无肝细胞变性坏死，肝纤维化，肝细胞及胆小管内有无胆汁淤积现象. 在实验第4 wk，取各组动物的肝脏标本，经上述方法处理后送重庆医科大学电镜室超薄切片（徕卡），枸橼酸铅及醋酸双氧铀染色，H600透射电镜观察.

　　统计学处理： 采用SAS8.0统计软件包对数据进行分析. 计量资料用x±s表示；组间比较，由于方差不齐，将原始数据进行对数转换后方差齐同，再采用方差分析，两两比较采用SNKq检验；P<0.05为有统计学显著性差异.A:肝细胞内胆色素颗粒; B:肝脏毛细胆管内胆汁淤积; C:肝细胞混浊肿胀和气球样变性; D:汇管区明显纤维增生; E:大黄组肝细胞轻度变性，少数毛细胆管淤胆; F:大黄组汇管区少量纤维增生; G:UDCA组肝细胞轻度变性，点状坏死; H:UDCA+D组肝细胞灶性坏死.

　　图1各组幼鼠肝脏的病理变化HE ×400（略）

　　2结果

　　光镜下，空白对照组：肝小叶结构完整，肝细胞形态正常. 无变性坏死、炎症细胞浸润和纤维组织增生等改变. 未治疗组：肝细胞内见胆色素沉积，毛细胆管内胆汁淤积（图1A，B）. 可见肝细胞大量混浊肿胀、空泡变性，汇管区较多纤维组织增生（图1C，D）. 表明给实验大鼠口服ANIT后，成功构建肝内胆汁淤积性黄疸动物模型. 大黄治疗组：肝细胞轻度变性，无肝细胞坏死，少数毛细胆管内胆汁淤积，汇管区少量纤维组织增生（图1E，F）. 表明大黄明显减轻了肝细胞的损伤，抑制肝纤维化. UDCA组：少数毛细胆管内胆汁淤积，肝细胞点状坏死、轻度浊变和空泡变性（图1G）. UDCA＋D组：肝细胞灶性坏死，少数毛细胆管内淤胆（图1H）. 电镜下，空白对照组：肝细胞核大，染色质丰富，核仁明显，可见双核仁，胞质内细胞器丰富清晰，可见发达的粗面内质网和高尔基复合体，成杆状或椭圆形的线粒体超微结构正常，细胞基质密度均匀一致，糖原散在分布于细胞质中. 未治疗组：肝细胞核不同程度溶解，异染色质边集，胞浆大片空化，有糖原堆积，脂滴增多，线粒体形态尚可，毛细胆管扩张，紧密连接打开. 变性坏死及线粒体肿胀明显，肝细胞内可见髓样结构. 血窦内可见成纤维样细胞及少量胶原纤维，少量纤维细胞呈现局灶性坏死(图2A，B，C). UDCA组： 少数肝细胞核异染色质边集，肝细胞间隙扩大，髓样结构增多，少数线粒体轻度内室肿胀，溶酶体增多(图2D). UDCA＋D组：肝细胞胞质空化，糖原增多，线粒体内室肿胀，少数肝细胞核异染色质边集，毛细胆管轻度扩张，微绒毛变短(图2E). 大黄组：大多数肝细胞超微结构基本正常，仅有少数肝细胞胞质呈局灶性溶解，其毛胆管结构清晰，无明显扩张(图2F). 各组大鼠血清TB, DB, ALT, ALP, TBA浓度有差异(表1,2).

　　3讨论

　　中药大黄已被广泛应用于临床肝胆疾病的.A: 未治组幼鼠肝内毛细胆管扩张，紧密连接打开（×25 000）; B:未治组肝细胞核溶解，异染色质边集，胞质大片空化，有糖原堆积，脂滴增多; C:未治组肝纤维化明显; D:UDCA组少数肝细胞核异染色质边集，线粒体轻度肿胀; E:UDCA+D组肝细胞胞质空化，糖原增多，线粒体肿胀，少数肝细胞核异染色质边集; F: 大黄组肝细胞基本正常，毛细胆管无明显扩张.

　　图2各组幼鼠肝脏的超微结构变化TEM ×8000（略）

　　表1大鼠血清TB，DB和TBA测定结果（略）

　　aP<0.05 vs未治疗.

　　表2血清中ALT，ALP测定结果（略）

　　aP<0.05 vs未治疗.

　　为深入探讨中药大黄对肝内胆汁淤积的治疗作用，建立肝内胆汁淤积性黄疸动物模型成为深入研究本课题的关键. 实验证明，异硫氰酸萘酯（ANIT）能诱发大鼠肝脏损害，引起血液中胆红素和丙氨酸转氨酶急剧升高，胆汁流量减少，炎性细胞增加以及肝细胞坏死等相似于人类肝内胆汁淤积的病理改变［6］. 从本实验中未治疗组的检测结果表明，由ANIT引起的高胆血症，以结合胆红素为主，符合胆汁淤积性黄疸特征，同时表明本组所建立的肝内胆汁淤积性黄疸模型是成功的. 血清总胆红素（TB），碱性磷酸酶（ALP），丙氨酸氨基转移酶（ALT），总胆汁酸（TBA）是胆汁淤积的4项常规指标［7］. 我们将这4项指标作为判断胆汁淤积程度的指标，同时也作为衡量胆汁淤积药物疗效的指标. 本实验结果显示：大黄、UDCA和UDCA+强的松对胆汁淤积均有效，大黄在退黄、降低血清胆红素、降低ALP和TBA方面疗效优于UDCA和UDCA+强的松，而在降低ALT方面无优势；UDCA+强的松退黄、降低ALT的作用稍强于UDCA. 肝组织学检查结果示：光镜下，大黄治疗减轻了肝细胞的损伤和胆汁淤积，抑制了肝纤维化. 电镜下，大黄治疗减轻了肝细胞的损伤和胆汁淤积，同时减轻了线粒体的损伤. 胆汁淤积属中医“黄疸”范畴，病机系湿热瘀毒郁阻血分，阻滞百脉，逼迫胆液外溢，浸渍肌肤所致. 大黄系通腑祛瘀的主要药物，具有通腑解毒、活血化瘀、攻逐湿浊、通便泻下等作用，不仅利肝胆湿热，还清泻血分之瘀热，并具降气、利尿、降黄疸、抗菌、抗毒等诸多功效. 本实验表明UDCA对胆汁淤积是有效的，但由于缺乏适合婴儿的剂型，限制了它在儿科的应用. 熊去氧胆酸（UDCA）是鹅去氧胆酸的7β表异构物，较鹅去氧胆酸及其他胆酸更具亲水性. 由于其表面活性弱，因此分裂、溶解膜质的倾向很弱，能稳定被疏水性胆酸结合的肝细胞膜，拮抗其细胞毒作用［7］. 肾上腺皮质激素对胆汁淤积有一定利胆退黄作用，但长期使用副作用多，多数学者认为认为激素对淤胆型肝炎并无突出的效果,目前的中医治疗对淤胆型肝炎有更好的效果,且没有激素的副作用. 本研究表明尽管加用激素后在降低TB，ALT方面疗效优于单用UDCA组，但是从病理改变看加用强的松后病情有加重的趋势，故胆汁淤积时是否加用激素治疗有待进一步探讨.

　　【】

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