链脲佐菌素致大鼠糖尿病性白内障的发病机制

              作者：丁正华，严宏，郭勇，哈文静，王建伟

【关键词】  糖尿病性白内障；链脲佐菌素；发病机制

　　　【Abstract】 AIM: To set up the diabetic cataract model and to explore the mechanism of diabetic cataract in rats induced by streptozotocin (STZ). METHODS: Diabetic rats were made by a single intaperitoneal injection of STZ (65 mg/kg). The changes of plasma glucose, urine glucose and body weight were monitored and the progression of lens opacification was recorded using the slit lamp every week. At 13th week, the levels of glutathione reductase (GR), catalase (CAT), glutathione (GSH) and glycated protein in lens were determined. RESULTS: About 70% (14/20) of the rats responded to the streptozotocin injection and the diabetic symptoms were observed in these rats. Only one rats （1/14） was rejected for the decrease of plasma glucose (<14 mmol/L). Lens opacification progressed in a biphasic manner in the diabetic rats, an initial slow progression during the first 8 weeks of diabetes followed by a steep increased lens opacification in the next 5 weeks. There was statistically significant difference between the diabetic group and the normal group in the level of CAT (nkat, 479.3±339.0 vs 1002.0±467.6), GSH (mg/g, 55.2±32.6 vs 102.7±39.1) and glycated protein (mmol glycation per mol protein,  5.4±0.5 vs 4.17±0.4) (P<0.05). CONCLUSION:The diabetic model induced by a single intaperitoneal injection of streptozotocin was reliable for study in diabetic cataract. Lens protein glycation and oxidative damage may play some significantcant roles in the development of diabetic cataract.

　　【Keywords】 diabetic cataract; streptozotocin; pathogenesis

　　【摘要】 目的：建立大鼠糖尿病性白内障模型，并探讨糖尿病大鼠晶状体混浊可能的发生机制. 方法：采用一次性腹腔内注射链脲佐菌素(STZ) (65 mg/kg)的方法建立大鼠糖尿病模型. 每周监测大鼠血糖、尿糖、体重的变化，并在裂隙灯下观察大鼠晶状体混浊的进展. 第13周测定晶状体中谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化氢酶(CAT) 活力以及谷胱甘肽(GSH)、糖化蛋白的含量. 结果: 70％(14/20)达成模标准，并出现糖尿病表现，其中1只大鼠（1/14）因血糖恢复至正常水平而被剔除. 糖尿病大鼠晶状体混浊呈两阶段，前8 wk缓慢进展及后5 wk快速进展. 糖尿病组与正常对照组晶状体中CAT (nkat，479.3±339.0 vs 1002.0±467.6)，GSH(mg/g，55.2±32.6 vs 102.7±39.1)，糖基化蛋白(每摩尔蛋白中生成糖基化蛋白的毫摩尔数，5.4±0.5 vs 4.17±0.4)比较，有统计学差异(P<0.05). 结论: 一次性腹腔内注射STZ致大鼠糖尿病模型是研究糖尿病性白内障的可靠模型，晶状体蛋白糖基化反应及氧化损伤可能在糖尿病性白内障发生起重要作用.

　　【关键词】 糖尿病性白内障；链脲佐菌素；发病机制

　　0引言

　　白内障是世界上首位致盲眼病［1］. 随着生活水平不断提高和人口老化，糖尿病患者日渐增多,糖尿病性白内障患者也在增加. 20世纪80年代以来, 国内外开始使用链脲佐菌素（STZ）制备糖尿病动物模型, 此模型有白内障合并症，现已用于糖尿病性白内障发病机制和药物的研究［2］. 我们观察了STZ 诱导的糖尿病性白内障模型的发生、发展过程，并探讨糖尿病性白内障可能的发生机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料SD大鼠25只，体质量90~160 g，雄性，1 mo龄，由第四军医大学实验动物中心提供. STZ, 5羟基糠醛（5HMF）为美国Sigma公司产品，血糖试纸由罗氏诊断产品有限公司（瑞士）生产，紫外可见分光光度计（Sp756型），上海光谱公司. 过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒、谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒、谷胱甘肽还原酶（GR）测定试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所.

　　1.2方法

　　1.2.1糖尿病大鼠模型的制备从25只大鼠中随机抽取5只为正常组，其余大鼠用于建立糖尿病大鼠模型，并给予STZ 65 mg/kg，ip（用0.1 mol/L，pH为4.5柠檬酸盐缓冲液配置）诱发糖尿病， STZ注射后72 h测定大鼠血糖，血糖>14 mol/L者纳为糖尿病组大鼠. 正常组大鼠腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液. 每笼5只饲养，饮用自来水，自由摄食，饲以大鼠常规颗粒饲料（第四军医大学实验动物中心提供）.

　　1.2.2大鼠一般情况的观察每日观察大鼠饮水、饮食量、尿量情况. 每周称量大鼠体质量，每4 wk大鼠尾端取血，滴于血糖试纸上准确反应5 s，使用罗氏血糖仪（爱康全）比色并记录，监测血糖变化，血糖低于14 mol/L的大鼠予以剔除.

　　1.2.3大鼠晶状体混浊程度的观察复方托吡卡胺滴眼液点大鼠双眼1次，5 s后使大鼠吸入乙醚蒸气而麻醉. 使用BQ900裂隙灯观察大鼠，每周根据晶体混浊情况分级. 分级标准牛津大学眼科实验室晶状体分级方法［3］.

　　1.2.4大鼠晶状体生化指标的测定13 wk时脱臼法处死大鼠，摘除眼球，分离晶状体，称量晶状体湿重，以1∶19生理盐水在0℃冰水中研磨，按南京建成生物工程研究所试剂盒说明测定晶状体中蛋白、GSH含量及CAT, GR的活性. 糖基化蛋白测定：①晶状体匀浆沉淀，5倍重100 g/L三氯乙酸（TCA）中研磨，4℃放置整夜；②10 000 g离心20 min，移去上清液，用同体积100 g/L TCA冲洗沉淀，10 000 g离心20 min，移去上清液. ③将沉淀放置于1 mL二乙基乙醚内，室温下放置10 min. 11 500 g离心5 min，移去上清液，用二乙基乙醚冲洗沉淀两次（1 mL和0.5 mL）. 将沉淀放置蒸发皿上，将二乙基乙醚挥发完. ④将沉淀称重，放入带旋盖的密封试管内，加入1 mol/L的草酸1mL. 标准管由0.02 g 5HMF和1 mol/L草酸1 mL组成，空白管为1 mol/L草酸1 mL. ⑤保持100℃ 2 h，再冷却到室温. 将溶液加入离心管并加入400 g/L TCA，在冷水内冷却10 min使蛋白沉淀. ⑥3500 g离心15 min，从每管移出1.6 mL上清液到埃道夫管，进一步11 500 g离心5 min. ⑦取出上清液0.75 mL加入0.05 mol/L硫代巴比妥酸（TBA） 0.25 mL，用1 mol/L氢氧化钠调pH至6.0，在波长为443 nm处读数. 使用不同浓度的5HMF测量绘制曲线图，查图晶状体糖基化蛋白含量.

　　统计学处理： 全部数据经SPSS 11.0统计软件处理. 正常组大鼠与糖尿病组大鼠血糖、体质量及酶含量的分析，经方差齐性检验，方差齐，采用两样本t检验. 正常组大鼠与糖尿病组晶状体混浊程度比较采用Wilcoxon rank sum test分析.

　　2结果

　　2.1实验过程中大鼠血糖监测STZ注射后共有14只大鼠血糖大于14 mol/L，占总数的70％（14/20）. STZ注射后72 h，4 wk，8 wk，12 wk，13 wk时糖尿病组大鼠血糖明显高于正常组大鼠(P<0.05，表1). STZ注射后第8周，糖尿病组大鼠中有1只大鼠血糖降于14 mol/L以下，占总数7.1％（1/14），予以剔除.

　　表1血糖变化(略)

　　aP<0.05 vs正常.

　　2.2实验过程中大鼠一般情况的观察糖尿病组大鼠自STZ注射后1 wk饮水、饮水、尿量明显增加，约为正常组的3倍. 正常组的大鼠随着时间的增加体质量增长，糖尿病组大鼠体质量缓慢增长，并逐渐出现糖尿病并发症，出现消瘦和多发感染，第9，10，12 wk时糖尿病组大鼠分别有1只死亡. STZ注射前两组大鼠体质量无明显差异(P>0.05). STZ注射后2~13 wk糖尿病组大鼠体质量明显低于正常组(P<0.05，图1).

　　aP<0.05 vs正常组.

　　图1实验中两组大鼠体质量变化(略)

　　2.3实验过程中大鼠晶状体混浊的观察正常组大鼠眼晶状体一直清亮. 糖尿病组大鼠STZ注射后3 wk晶状体开始出现混浊，与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.05). STZ注射后3~8 wk晶状体混浊进展缓慢，STZ注射后9~13 wk晶状体混浊进展加快(图2).

　　图2实验中糖尿病组大鼠晶状体混浊的观察(略)

　　2.4大鼠晶状体中生化指标的测定大鼠晶状体中水溶蛋白,GSH,糖基化蛋白含量及CAT，GR活性测定结果, 糖尿病组大鼠晶状体中GSH含量及CAT活性与正常组相比明显下降(P<0.05)；糖尿病组大鼠晶状体中糖基化蛋白含量明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05). 糖尿病组大鼠晶状体中GR活性与正常组大鼠相比，差异无统计学意义(P>0.05, 表2).

　　表213 wk时大鼠晶状体中蛋白及酶的测定(略)

　　aP<0.05 vs正常.

　　3讨论

　　STZ是具有诱发糖尿病的高度特异性［4］，对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用［5］. 70％的注射STZ的大鼠达成模标准，其中7.1％的患糖尿病大鼠在生长过程中血糖恢复正常水平，这可能因为部分大鼠胰岛细胞再生能力旺盛或剩余胰岛细胞代偿功能好. 糖尿病组所有大鼠晶状体都出现混浊，结果显示：前3～8 wk晶状体混浊进展相对缓慢，第8～13 wk晶状体进展相对迅速，第13周时所有糖尿病大鼠晶状体完全混浊. 一般认为糖尿病性白内障的发生有以下三种原因：晶状体渗透压改变、氧化损伤以及晶状体蛋白非酶糖基化作用，而且这三种作用相互影响. 葡萄糖自动氧化和非酶糖基化可统称为糖的氧化作用,主要是增加晶状体中的自由基. 自由基氧化损伤［6］可致晶状体蛋白质分子构型改变，致其SH外露, 互相连接形成二硫键聚合物，致高分子不溶性蛋白增多［7］. 本研究显示：糖尿病组大鼠晶状体中重要抗氧化酶GSH含量及CAT活性与正常对照组相比明显下降，这说明糖尿病大鼠晶状体抗氧化损伤的能力下降，所以导致白内障的形成. 蛋白质的非酶糖化是指机体在无需酶催化的条件下,蛋白质和葡萄糖之间自动发生的缓慢而持久的形成糖基化蛋白的过程. 糖化的过程首先是开链的葡萄糖的醛基和蛋白质氨基酸上的游离氨基结合生成不稳定的Schiff碱和Amadori产物，进而形成不可逆的糖基化末端产物（AGEs）［8］，导致AGEs堆积，晶状体蛋白变性. 本研究显示：糖尿病组大鼠晶状体中糖基化蛋白含量与正常对照组相比明显增加，这表明晶状体蛋白糖基化反应在糖尿病白内障发生中起重要作用. 进一步应用抗氧化药物及抗糖基化药物防治糖尿病性白内障的研究有助于进一步了解糖尿病白内障的发生机制.

　　【】

　　［1］ Brian G, Taylor H. Cataract blindnesschallenges for the 21st century ［J］. Bull World Health Organ,2001, 79(3): 249-256.

　　［2］ Sima AA, GarciaSalinas R, Basu PK. The BB Wistar rat: an experimental model for the study of diabetic retinopathy ［J］. Metabolism, 1983,32(7):136-140.

　　［3］ Ajiboye R, Harding JJ. The nonenzymic glycosylation of bovine lens proteins by glucosamine and its inhibition by aspirin, ibuprofen and glutathione ［J］. Exp Eye Res, 1989,49(1): 31-41.

　　［4］ Junod A, Lambert AE, Orci L, et al. Studies of the diabetogenic action of streptozotocin ［J］. Proc Soc Exp Biol Med,1967,126(1): 201-205.

　　［5］ Rakieten N, Rackieten ML, Nadkarni MV. Studies on the diabetogenic action of streptozotocin ［J］. Cancer Chemother Rep,1963,29:91-98.

　　［6］ Frederikse PH, Garland D, Zigler JS， et al. Oxidative stress increases production of betaamyloid precursor protein and betaamyloid (Abeta) in mammalian lenses, and Abeta has toxic effects on lens epithelial cells ［J］. J Biol Chem, 1996, 271(17): 10169-10174.

　　［7］ Devamanoharan PS, Ali AH, Varma SD. Prevention of lens protein glycation by taurine ［J］. Mol Cell Biochem, 1997, 177(12): 245-250.

　　［8］ Sell DR, Nagaraj RH, Grandhee SK, et al.. Pentosidine: a molecular marker for the cumulative damage to proteins in diabetes, aging, and uremia ［J］. Diabetes Metab Rev, 1991, 7(4): 239-251.