种植于硅橡胶膜上的大鼠纤维环细胞的表型特征研究
作者：郭志良，周跃，成敏，曹国永，李华壮，滕海军
【关键词】 纤维环细胞；硅橡胶膜；逆转录
Phenotypic characteristics of rat annulus fibrosus cells cultured on flexible silicone membranes
【Abstract】 AIM: To compare the phenotypic characteristics of rat annulus fibrosus (AF) cells cultured on flexible silicone membranes with the same cells cultured in plastic plates. METHODS: The morphology of AF cells cultured in different substrates was observed under an inverted phasecontrast microscope and a transmission electron microscope. Proteoglycan was stained with toluidine blue for observing its expression. The contents of collagen typeⅠ, Ⅱand aggrecan mRNA were determined by RTPCR. The expression of integrin β1 was monitored by flow cytometry. Cell adhesion to silicone membranes was also measured. RESULTS: The AF cells cultured in different substrates were morphologically undistinguishable. Toluidine blue staining showed that there was also no difference between AF cells cultured on flexible silicone membranes and in plastic plates. The cells growing in different substrates expressed the same levels of collagen typeⅠ, Ⅱ and aggrecan mRNA and integrin β1. AF cells grew well on silicone membranes. CONCLUSION: AF cells cultured on flexible silicone membranes maintain the stability of phenotype and may be appropriate for further studying the metabolic responses to mechanical stimuli at the cellular level.
【Keywords】 annulus fibrosus cell; silicone membrane; reverse transcriptasepolymerase chain reaction; flow cytometry
【摘要】 目的：比较种植于硅橡胶膜或塑料培养板的大鼠纤维环细胞的表型特征. 方法：利用倒置相差显微镜及透射电镜观察种植于不同基质的大鼠纤维环细胞形态的变化；利用甲苯胺蓝染色观检测蛋白多糖的表达情况；通过RTPCR法检测Ⅰ，Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA的表达情况；采用流式细胞术观察细胞表面整合素β1的表达情况；同时检测了纤维环细胞在硅橡胶膜上的黏附情况. 结果：种植于不同基质的纤维环细胞形态学观察无明显差别；在两种基质上的纤维环细胞甲苯胺蓝染色无差异；Ⅰ，Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA及细胞膜整合素β1的表达亦无明显差异；纤维环细胞可以黏附于硅橡胶膜上生长. 结论：种植于硅橡胶膜上的纤维环细胞表型特征无改变，为进一步研究力学刺激对纤维环细胞的影响提供实验基础.
【关键词】 纤维环细胞；硅橡胶膜；逆转录聚合酶链式反应；流式细胞术
0引言
下腰痛是一个重要的公共卫生问题，虽然引起下腰痛的原因很多，但是椎间盘退变仍是其主要因素［1-2］. 目前的观点认为，椎间盘退变是一个由生物化学和生物力学因素相互作用的复杂的病理过程. 由于椎间盘周围的肌肉、韧带以及椎间盘内的静水压等因素，椎间盘始终处于负荷状态，尤其是椎间盘纤维环细胞总是不断地受到不同形式的拉伸应力. 为了从细胞水平研究生物力学因素对细胞的影响，很多研究者设计出不同的实验装置，对体外培养细胞施加不同形式的拉伸应力［3-4］. 我们也自行设计一套对单层生长细胞进行周期性张应变的实验装置，为对细胞施加张应力，首先需要将纤维环细胞培养于弹性硅橡胶膜上，因此有必要对培养于新的基质上的细胞表型稳定性进行确认. 细胞生长基质可影响细胞外基质成分的表达，本实验我们比较了培养于硅橡胶膜和细胞培养板上的纤维环细胞的细胞外基质成分的表达情况.
1材料和方法
1.1材料SD大鼠(1月龄)由本院实验动物中心提供. DMEM培养基和Ⅱ型胶原酶为Gibco公司产品，胎牛血清为PAA公司产品，纤维连接素为Roche公司产品，Hepes为Amresco公司产品，TRIzol试剂为Invitrogen公司产品，一步法RTPCR试剂盒为Qiagen公司产品，FITC标记抗整合素β1单抗为BD公司产品. 硅橡胶膜为Dow Corning公司产品，细胞培养板为Corning公司产品，凝胶成像系统为Alpha Innotech公司产品，流式细胞仪为美国BD公司，透射电镜为日立公司产品.
1.2方法
1.2.1纤维环细胞的分离培养［5］方法，大鼠处死后，常规消毒，无菌条件下取下脊椎，立即置入盛有PBS液的培养皿中，去除椎间盘周围的软组织，将L5~L10椎间盘从中间切开，小心刮除髓核组织，然后用尖刀片将纤维环仔细取下，于PBS液中漂洗三遍，然后用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，置2.5 g/L胰蛋白酶中，37℃下10 min，加入含血清培养基终止消化，用PBS液清洗去除胰蛋白酶，将组织块置1 g/L的胶原酶溶液中，37℃下消化2 h, 200目滤网过滤，细胞悬液1000 r/min离心5 min，得细胞团，PBS液清洗细胞三次，清洗后的细胞，以DMEM（含100 mL/L的胎牛血清，20 mmol/L HEPES, 100万U/L青霉素和100 mg/L链霉素）悬浮，接种于培养瓶中，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 待细胞生长汇合时，用胰蛋白酶消化，传代细胞接种于细胞培养板和自制的细胞培养槽中，培养槽的底由硅橡胶膜制成，用5 μg/cm2的纤维连接素包被.
1.2.2甲苯胺蓝染色和透射电镜观察单层生长的细胞用40 g/L多聚甲醛固定，0.4 g/L甲苯胺蓝染色，蛋白多糖为深紫色. 通过离心的方法收集细胞团块，用戊二醛和锇酸固定，透射电镜观察.
1.2.3逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）细胞总RNA的提取采用TRIzol试剂，根据操作说明书进行. 紫外分光光度计分别于260 nm和280 nm波长测定RNA的纯度（A260 nm/A280 nm=1.8~2.0）及定量. 目的基因的扩增采用一步法RTPCR试剂盒，所用引物情况：Ⅰ型胶原（上游：5′ggtcacagcagactggaaacatcg3′，下游：5′agggtagggagcagcagcaagag3′；产物长度：487 bp；退火温度：54℃）；Ⅱ型胶原（上游：5′cgaggtgacaaaggagaagc3′，下游：5′ctggttgttcagcgacttga3′；产物长度：453 bp；退火温度：55℃）；可聚蛋白聚糖核心蛋白（上游：5′cgcttgccagggggagttgtattc3′，下游：5′ggaggccagggtagcattttgagc3′； 产物长度：405 bp；退火温度：55℃）；GAPDH（上游：5′tgctgagtatgtcgtggagt3′，下游：5′agtctt ctgagtggcagtgat3′； 产物长度：287 bp；退火温度：51℃）. 反应条件为：50℃，30 min；15℃， 15 min；94℃， 1 min；退火温度，45 s；72℃，1 min；30循环；72℃，10 min. PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，摄像后用图像分析软件进行条带灰度分析. 结果用目的条带和GAPDH条带的灰度比值表示.
1.2.4流式细胞术单层生长的细胞用PBS洗2遍，然后通过消化和离心的方法收集细胞，细胞用FCM缓冲液（含20 g/L牛血清白蛋白和0.1 g/L叠氮钠无Ca2+，Mg2+的PBS）重悬，调整密度为109/L，细胞用FCM缓冲液洗涤后，进行抗体孵育. 离心后的细胞中加入200 μL (50 mg/L，用FCM缓冲液稀释) FITC标记的抗整合素β1抗体，4℃避光孵育30 min，然后用PBS洗涤3次，上流式细胞仪检测，激发波长为488 nm. 每组样本检测10 000个细胞，所测得细胞荧光强度代表了整合素β1的表达情况. 同时，做阴性对照实验.
1.2.5细胞贴壁情况为检测细胞在硅橡胶膜上的黏附情况，我们分别在细胞接种后的3，6，12和24 h，对贴壁细胞进行计数，细胞贴壁率为贴壁细胞数与总细胞数之比. 细胞接种48 h后，进行换液，然后对细胞施加3，6和12 h的应变为10%，频率为2 Hz的周期性张应变. 受力后对培养基中的脱落细胞进行计数，然后将仍然贴壁的细胞消化下来进行计数，脱落细胞和贴壁细胞的比值，与未受力组相比较.
统计学处理：所有实验均重复3次，结果用x±s表示，统计分析采用独立样本t检验和χ2检验，P<0.05为有统计学差异.
A：培养板上细胞； B：硅橡胶膜上细胞.
图1倒置相差显微镜观察纤维环细胞的形态×200（略）
2结果
2.1细胞形态和结构高密度接种的原代纤维环细胞，在2 wk生长汇合，然后将细胞消化下来，传代至硅橡胶膜或细胞培养板上. 在这两种培养条件下，细胞均呈现圆形或多角形，单层生长，两者之间无形态上的差异（图1）. 第一代细胞生长速度加快，大约1 wk可生长汇合，本实验仅使用第一代细胞.
透射电镜观察培养纤维环细胞，可见其具有软骨细胞的结构特征，在两基质上生长的细胞在超微结构上未显示出差异（图2）.
A：培养板上细胞； B：硅橡胶膜上细胞.
图2生长于不同基质的纤维环细胞的超微结构×6000（略）
2.2细胞外基质的表达情况无论是生长在培养板的纤维环细胞还是硅橡胶膜上小细胞，两者表现出相同的对甲苯胺蓝的异染性（图3）.
A：培养板上细胞； B：硅橡胶膜上细胞.
图3不同基质培养的纤维环细胞甲苯胺蓝染色×200（略）
通过对培养于不同基质的纤维环细胞Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和可聚蛋白聚糖核心蛋白mRNA的检测，在mRNA水平，未检测出在不同的培养基质生长的细胞，细胞外基质表达的不同（P>0.05，图4，5）.
1, 4：Ⅰ型胶原; 2, 5：Ⅱ型胶原；3, 6：可聚蛋白聚糖.
图4不同培养基质上的纤维环细胞Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和可聚蛋白聚糖核心蛋白mRNA的表达（略）
图5Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和可聚蛋白聚糖核心蛋白mRNA的表达的半定量分析（略）
2.3整合素β1的表达在本实验中未检测出在不同基质生长的纤维环细胞，整合素β1表达的不同，其相对荧光强度分别为819±30和814±33（P>0.05，图6）.
图6流式细胞术检测不同培养基质的纤维环细胞整合素β1表达情况（略）
2.4细胞黏附接种于硅橡胶膜上的纤维环细胞，在接种后3，6，12和24 h的贴壁率分别为（65±8）%，（81±7）%，（91±10）%和（99±3）%，与在培养板上的相比没有统计学差异（P>0.05）. 在施加3，6，12 h的周期性张应变后细胞的脱落率分别为（5.6±1.0）%，（5.2±1.1）%，（5.0±0.9）%，与未施加应变组［（5.8±0.9）%，（5.4±0.8）%，（5.0±0.7）%］比较无差异（P>0.05）.
3讨论
在脊柱运动过程中，纤维环细胞受到张应力刺激，机械刺激可以影响纤维环细胞的代谢已为很多研究者所接受. 研究者设计了很多的实验装置，可以在细胞水平研究纤维环细胞对应力刺激的代谢响应［6-7］. 我们也自行设计了一套实验装置，为了对细胞施加应力，必须将细胞培养于弹性硅橡胶膜上，因此有必要对培养于硅橡胶膜上的纤维环细胞的表型稳定性进行研究. 在体外高密度培养的纤维环细胞表达纤维软骨特异性的基质蛋白，可以表达Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和蛋白多糖［5］. 本实验中，我们将大鼠椎间盘纤维环细胞培养于纤维连接素包被的弹性硅橡胶膜上，以便对其施加应力刺激. 根据Brodkin等［8］的研究，纤维连接素、Ⅰ型胶原或Ⅱ型胶原基质不影响软骨细胞的形态、基因表达、细胞外基质的形成以及细胞骨架的构造. 我们的结果提示纤维连接素包被的弹性硅橡胶膜上生长的纤维环细胞可以保持其表型稳定，与培养板上的细胞没有差别. 整合素作为一种重要的细胞黏附分子，可以介导细胞与周围基质的相互作用. 在许多种细胞中，整合素同样参与信号转导，调节细胞的基因表达、细胞增殖及凋亡［9-12］. Nettles等［13］发现纤维环细胞表达整合素β1亚基. 在本实验中，培养在不同基质的纤维环细胞表达同样的整合素β1亚基，二者并无不同. 另外，细胞在硅橡胶膜上的贴壁率与在培养板上没有区别. 这些结果提示，本实验中的培养条件对于纤维环细胞的生长是合适的. 最后，我们对生长于硅橡胶膜上的细胞给以应变为10%, 频率2 Hz的周期性张应变，细胞没有从弹性膜上脱落下来.
我们研究说明，纤维连接素包被的弹性硅橡胶膜具有好的生物相容性，大鼠椎间盘纤维环细胞可以在其上生长，并保持起生物学特性. 本实验装置可以用于周期性张应变对纤维环细胞在细胞水平的影响研究.
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