心肌梗死大鼠心脏ACE2基因的表达意义
【关键词】 大鼠；ACE2,mRNA；心肌梗死
Expression of ACE2 mRNA in rat myocardium after acute myocardial infarction and its significance
【Abstract】 AIM: To investigate the changes of the mRNA expression of ACE2 after acute myocardial infarction (AMI) in SD female rat. METHODS: Thirtysix SD female rats were randomly separated into 3 groups (n=12 in each one) according to the infarction duration (1, 3, 28 d), which were randomly and evenly again separated into 2 subgroups: operated group and sham operated group. The levels of mRNA expression of ACE2 in the noninfarct and infract area of left ventricle 1, 3, 28 d after AMI were detected by RTPCR and analyzed semiquantitatively by imageanalysis system. RESULTS: Compared with sham operated group, the mRNA expression of ACE2 had no significant difference in the infract and noninfarct areas of operated group at day 1 after AMI (P>0.05). The mRNA expression of ACE2 increased in the infract area compared with the noninfarct area at day 3 after AMI (P<0.01). At day 28, increase of ACE2 mRNA expression were also seen in the noninfarct area of AMI rats compared with the myocardium of control rats (P<0.01). CONCLUSION: The gene expression of ACE2 at mRNA level was significantly increased in the myocardium after AMI.
【Keywords】 rats; ACE2 mRNA; myocardial infarction
【摘要】 目的：研究大鼠ACE2的mRNA在急性心肌梗死（AMI）后大鼠心脏组织中的表达. 方法：将36只SD雌性大鼠按时间段随机分为3组（每组12只），每组再随机分为假手术组、手术组2个亚组（每组6只），应用RTPCR方法检测大鼠AMI后1，3，28 d左心室梗死区及非梗死区心肌ACE2 mRNA的表达，并以图像分析系统对其进行半定量分析. 结果：在AMI后1 d，与假手术组相比，手术组梗死区及非梗死区ACE2 mRNA水平均无差异（P>0.05）. 在AMI后3 d，与手术组非梗死区相比，手术组梗死区ACE2 mRNA水平明显升高(P<0.01). 在AMI后28 d，与假手术组相比，手术组非梗死区ACE2 mRNA水平也明显升高(P<0.01). 结论：AMI后ACE2 mRNA表达增多.
【关键词】 大鼠；ACE2 mRNA；心肌梗死
0引言
血管紧张素转化酶2（ACE2）可能通过肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）或通过对一些新型调节肽系统的调制作用来调节心血管的功能, 但是否参与AMI后机体对心肌缺血缺氧的调节反应还不清楚. 我们从基因转录水平（mRNA）观察SD大鼠AMI后梗死区及非梗死区的左心室肌细胞ACE2 mRNA表达量的变化.
1材料和方法
1.1材料总RNA抽提试剂盒(Trizol试剂盒)由Invitrogen公司提供, RTPCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司. ACE2引物及内参基因引物, 以及PCR产物测序由上海生物工程技术服务有限公司完成. 低温离心机(贺利氏228RS，德国). 紫外光分光光度仪(导津22201，日本), PCR 仪(Biometra，德国)，电泳仪(京华，北京). 全自动凝胶成像分析系统(法码西亚，美国). SD大鼠(武汉大学医学院实验动物中心提供)36只, 成年雌性，质量200~250 g，随机分为1 d组（n=12）, 3 d组(n=12), 28 d组(n=12). 每组再随机分为对照组（假手术组）、手术组（心梗组）2个亚组. 大鼠用200 g/L乌拉坦(200 mg/kg) ip麻醉，同时行气管插管，接小动物呼吸机给予通气. 然后左侧开胸术，打开心包，用5~0丝线在左心耳下1～2 mm处结扎左前降支近端. 其成功标志为：心电图ST段弓背向上抬高或出现病理性Q波，直视下可见被结扎血管供应区心肌变为苍白色或发生区域性运动障碍. 对照组重复上述步骤，不结扎冠状动脉. 结扎中存活的大鼠和对照组大鼠接受相同的饲养条件，包括任意食物，水和每12 h昼/夜循环. 术后给予青霉素100 000 U im预防感染.
1.2方法乌拉坦麻醉下打开胸腔, 迅速取出心脏，置于4.0℃预冷的生理盐水漂洗除去过量的血液. 小心切去右心室和右心耳，仅保存左室非梗死区域及梗死区域. 剪碎后，放入液氮中保存. 取左室梗死区和非梗死区心肌组织各100 mg，用Trizol试剂抽提心肌组织总RNA，各RNA样本A260 nm/A280 nm的比值均为1.8～2.0. 根据Genebank的序列，并相关［1］，分别设计ACE2，GAPDH，并由上海生物工程技术服务有限公司合成. 用RTPCR试剂盒进行逆转录和扩增反应. PCR反应体系：cDNA 4 μL, Takara Taq 0.5 U，MgCl2 30 μmol/L，8 pmol上下游引物，10×PCR Buffer，加入去离子水至总体积20 μL. GAPDH基因反应条件：94.0℃ 5 min，首次循环94.0℃ 30 s，55℃ 30 s，72.0℃ 45 s，共32个循环，结束前72.0℃ 10 min，4.0℃ 5 min. ACE2基因反应条件：94.0℃ 5 min，首次循环94.0℃ 30 s，57℃ 30 s，72.0℃ 45 s，共32个循环，结束前72.0℃ 10 min，4.0℃ 5 min. PCR产物经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳，用全自动凝胶成像分析系统对凝胶成像，用ImageTool2.0分析各电泳条带灰度积分，以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的灰度积分作为标准校正. ACE2 PCR产物的相对量=ACE2电泳条带灰度积分/GAPDH电泳条带灰度积分，进行半定量分析. 对PCR产物进行测序，由上海生物工程有限公司测序部完成.
统计学处理：所有数据以x±s表示, 应用SPSS 11.5统计软件，组间均数比较用方差分析，P<0.05认为有统计学意义.
2结果
应用PCR上下游引物对其产物进行正向和反向测序，把目标基因扩增片段测序结果与Gene Bank目标基因全序列应用Blast引擎进行比较，目标基因ACE2被扩增片段的序列与其所在基因上的相应序列一致(图1). 在d 1，与假手术组相比，手术组梗死区及非梗死区ACE2 mRNA水平均无差异（P>0.05，表1）. 在d 3，与假手术组相比，手术组梗死区ACE2 mRNA水平明显升高（P<0.01)，手术组非梗死区ACE2 mRNA水平无改变；与手术组非梗死区相比，手术组梗死区ACE2 mRNA水平明显升高（P<0.01). d 28，与假手术组相比，手术组梗死区及非梗死区ACE2基因mRNA均水平明显升高（P<0.01)；与手术组非梗死区相比，手术组梗死区ACE2 mRNA水平无差异.
A: 1 d; B: 3 d; C: 28 d.1: 假手术； 2: 非梗死区； 3: 梗死区； M: Marker.
图1大鼠AMI后ACE2 mRNA表达水平（略）
表1大鼠AMI后ACE2 mRNA水平变化（略）
bP<0.01 vs假手术和急性心梗非梗死区； cP<0.01 vs假手术.
3讨论
近年来有研究表明，ACE2在人和啮齿类动物的心脏中高度表达，而且ACE2的作用与ACE相拮抗，ACE将AngⅠ转化为强的缩血管物质AngⅡ，ACE2则将AngⅡ转化为强舒血管物质Ang17，从而平衡肾素血管紧张素系统，达到调节心脏功能的作用［2］. 又有报道表明RAAS的组成成分ACE, AngⅡ等在AMI后被激活［3］，但AMI后有关ACE2的研究尚未见报道. 本研究发现在大鼠AMI的早期（d 3），梗死区ACE2 mRNA的表达即增加，并持续到第28日，到第28日非梗死区ACE2 mRNA的表达也增加. AMI后ACE2的增加可能对心肌缺血后激活的肾素血管紧张素系统进行负性平衡调节起到重要作用，主要是通过增加舒血管物质Ang17的水平来限制心肌AngⅡ水平增加产生的负效应，从而有利于心脏功能的保护Crackower等［4］研究发现小鼠在ACE2基因敲除后表现出心室腔扩大和心肌收缩能力减退，AngⅡ水平增加，而且缺氧诱导基因的表达增多，进一步将ACE和ACE2双基因敲除后，发现与ACE2敲除小鼠相比，双基因敲除小鼠心功能完全正常. 充分说明了ACE2能够调节心脏的收缩性，降低心脏的AngⅡ水平，及减少缺氧诱导基因的表达. 目前有研究发现：G蛋白藕联受体（Mas）是Ang17的高亲和力功能性受体，Ang17是一种血管舒张因子，通过与特异性受体Mas结合，通过激肽、NO，前列腺素等途径拮抗AngⅡ所产生的病理生理效应［5-6］. 因此推断ACE2对AMI及其后的心衰的保护效应可能是通过调节心脏的收缩性，降低心脏的AngⅡ水平，生成一定量的Ang17及减少缺氧诱导基因的表达等一系列效应来发挥的. 本试验还发现ACE2也参与了AMI后期非梗死区心肌细胞的保护作用，其保护途径可能与上面类似. 总之，本研究表明通过提高ACE2水平可能为心梗及随后的心衰的提供一种可能性. 对ACE2 和Ang17作用的干预将可能是今后治疗心血管和其他相关疾病的一个很有前途的方向.
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