外源性IL

【关键词】  Bcl

　　Effects of  exogenous IL18 gene on the proliferation and related gene expression in C6 glioma cells

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of exogenous IL18 gene on the proliferative ability and related gene expression in transfected C6 glioma cells. METHODS: The cell cycle distributions and proliferation index of C6/IL18 and its parental C6 cells were detected by flow cytometry. RTPCR, immunocytochemistry and Western blot analysis were applied to test the  mRNA  and protein expression of  cyclin D1, cyclin B1 and Bcl2 in C6/IL18 and C6 cells respectively. RESULTS: Compared with C6 cells, C6/IL18 cells were arrested at G0/G1 phase with fewer G2/M cells. The proliferation index of C6/IL18 cells was lower than that of C6 cells. At both mRNA and protein levels, the Bcl2, cyclin B1 and cyclin D1 expression in C6/IL18 cells were decreased. CONCLUSION: Exogenous IL18 gene  could reduce the proliferative ability of C6 cells by inhibiting the progress of cell cycle and downregulating the Bcl2, cyclin B1 and cyclin D1 expressions.

　　【Keywords】 Bcl2; cyclin; C6 glioma cell; IL18 gene transfection; proliferation index

　　【摘要】 目的：研究IL18基因转染对C6胶质瘤细胞增殖活性及相关基因表达的影响. 方法：用流式细胞仪观察C6/IL18细胞周期、增殖指数的变化；用RTPCR，蛋白印迹、免疫细胞化学方法分析C6/IL18细胞cyclin D1，cyclin B1，Bcl2 mRNA及蛋白的表达. 结果：与亲代C6细胞相比，C6/IL18细胞表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少，细胞增殖指数（PI）降低. C6/IL18细胞的cyclin D1和cyclin B1，Bcl2 mRNA及蛋白表达降低. 结论： 外源性IL18基因可降低C6细胞的增殖活性，其机制可能与Bcl2，cyclin B1和cyclin D1表达下调有关.

　　【关键词】 Bcl2；细胞周期蛋白；C6胶质瘤细胞；IL18基因转染；增殖指数

　　0引言

　　细胞因子基因修饰的肿瘤细胞疫苗，可通过靶基因表达而发挥其抗肿瘤作用，同时可提高肿瘤的免疫源性，激发机体的免疫反应，已成为目前研究的热点. 有研究报道表明，IL18基因修饰的肿瘤细胞疫苗具有激发机体的抗肿瘤免疫反应、抑制肿瘤生长的作用［1］. 一般认为，IL18可通过活化NK细胞，促进T细胞的增殖及诱导NK细胞、T细胞产生IFNγ而发挥其抗肿瘤作用. 同时，也有研究报道IL18在体外有直接杀灭肿瘤细胞的作用［2］. 我们将IL18基因导入C6胶质瘤细胞，成功建立了能够稳定表达具有生物活性IL18的C6/IL18系，并观察到C6/IL18细胞的体内致瘤性、体外增殖能力明显降低［3］. 但对其具体作用机制尚需进一步了解. 本实验旨在探讨C6/IL18 细胞增殖相关基因表达的改变，为IL18基因介导的抗肿瘤作用研究与应用提供资料.

　　1材料和方法

　　1.1材料大鼠C6/IL18细胞(逆转录病毒介导IL18基因转染的C6胶质瘤细胞)，C6胶质瘤细胞均由本室保存. Trizol及PCR试剂为Promega公司产品. 鼠抗人细胞周期蛋白D1（cyclin D1），Bcl2一抗，兔抗人细胞周期蛋白B1（cyclin B1）一抗为Santa Cruz产品，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠/兔二抗购自北京中山生物技术公司，RTPCR引物由北京赛百盛基因公司合成. RPMI 1640培养基为Sigma公司产品.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养C6/IL18细胞、C6细胞以RPMI 1640培养基培养，内含100 mL/L胎牛血清、青霉素100 U/mL, 链霉素100 μg/mL. 置37℃, 50 mL/L CO2培养箱培养.

　　1.2.2流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期细胞，0.4 g/L EDTA消化、离心，用冷PBS洗两次，700 mL/L乙醇固定24 h. 上机前离心去乙醇，再以PBS洗涤1次. 用含10 μg/mL RNA酶、10 μg/mL溴化乙锭染液4℃染色30 min. 经尼龙网过滤后，用FACSTARCalibur型流式细胞仪检测. 应用DNA细胞周期分析软件DNA组方图G0/G1, S, G2/M期的百分比, 以细胞增殖指数（proliferation index, PI）表示细胞增殖活性，计算公式为PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M).

　　1.2.3引物设计根据核苷酸序列用Premier 5.0软件设计引物. Cyclin D1上游引物为： 5′GCG TAC CCT GAC ACC AAT C3′，下游引物为：5′CCT CCT CTT CGC ACT TCT G3′， 扩增产物长度为184 bp； Cyclin B1上游引物为： 5′AAA ATA AGG CCA AGG TCA G3′，下游引物为：5′GCA  AGA ATC ACA TCG GAG A3′，扩增产物长度为385 bp；Bcl2上游引物：5′CGG GAG AAC AGG GTA TGA3′，下游引物：5′CAG GCT GGA AGG AGA AGA T3′，扩增产物长度为149 bp；βactin上游引物为:5′GAG GGA AAT CGT GCG TGA C3′，下游引物为: 5′CTG GAA GGT GGA CAG TGA G3′，扩增产物长度为445 bp.

　　1.2.4RNA提取与cDNA合成取对数生长期C6细胞、C6/IL18细胞，按Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA，取2 μg细胞总RNA为模板逆转录成cDNA. 反应条件为：42℃逆转录30 min，95℃ 5 min灭活AMV逆转录酶.

　　1.2.5PCR反应取2 μL逆转录产物以βactin为内参照进行PCR扩增. 条件为95℃预变性10 min，95℃变性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸40 s，共30个循环，72℃再延伸10 min. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果、照相，用凝胶图像分析系统分析结果，分别计算C6/IL18细胞、C6细胞条带的光密度与相对的βactin条带光密度的比值，该值为各目的基因mRNA表达的相对水平. 本实验重复3次.

　　1.2.6免疫细胞化学检测Bcl2蛋白表达分别取对数生长期C6/IL18和C6细胞，0.4 g/L EDTA消化后，加入培养液吹打混匀. 以108/L密度接种于预先置有消毒盖片的6孔培养板中，待细胞爬满盖片后用40 g/L多聚甲醛固定40 min，30 mL/L过氧化氢10 min. 3 g/L triton X100处理10 min, 100 mL/L正常羊血清处理15 min；cyclin D1, cyclin B1, Bcl2一抗(1∶100) 4℃孵育过夜. 用PBS代替一抗作为阴性对照. 羊抗鼠/兔生物素标记的二抗37℃孵育40 min；过氧化物酶标记链霉卵白素37℃孵育40 min, 0.5 g/L DAB显色、苏木精复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片，光镜下观察.

　　1.2.7蛋白印迹检测Cyclin D1，cyclin B1蛋白表达分别取对数生长期C6/IL18细胞与C6细胞，提取蛋白. 用考马斯亮蓝G250试剂盒，在分光光度计595 nm下检测样本的吸光值（A值）并计算蛋白的浓度. 每孔加入70 μg胞浆蛋白或(50 μg胞核蛋白进行SDSPAGE 凝胶电泳，将靶蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素膜（NC）膜，进行丽春红染色，根据蛋白码克以确定转膜效果及靶蛋白的位置. NC膜在50 g/L脱脂奶粉中封闭1 h，按0.1 mL/cm2膜加入一抗（1∶100），4 ℃静置过夜. 然后37℃与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠/兔IgG抗体温育1 h，利用化学发光法进行显色反应、照相及观察结果.

　　统计学处理： 实验结果以x±s表示，用SPSS 11.0统计软件进行t检验. P<0.05为有显著性差异.

　　2结果

　　2.1细胞周期分布流式细胞仪分析结果表明C6/IL18主要表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少，细胞增殖指数（PI）降低. 说明C6/IL18较亲代C6细胞增殖能力降低(表1).

　　表1C6/IL18细胞周期及增殖指数变化(略)

　　aP<0.05，bP<0.01 vs C6.

　　2.2RTPCR检测PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后在各泳道的445 bp处观察到βactin的电泳条带，在184, 385和149 bp处分别观察到cyclin D1，cyclin B1，Bcl2的电泳条带（图1）. C6/IL18细胞cyclin D1，cyclin B1，Bcl2与βactin的A比值分别为0.67±0.06，0.66±0.08和0.68±69±0.10，C6细胞cyclin D1，cyclin B1，Bcl2与βactin的A比值分别为1.16±0.13，0.95±0.09和0.85±0.09. 与C6细胞相比，C6/IL18细胞cyclin D1，cyclin B1，Bcl2 mRNA表达均降低(P<0.05).