hTERT基因启动子调控HSV
【关键词】 端粒,末端转移酶；启动区（遗传学）；宫颈肿瘤；tk基因
【Abstract】 AIM: To observe the killing effect of HSVtk/GCV system on cervical carcinoma cells under the control of hTERT(human telomerase reverse transcriptase) core promoter. METHODS: An eukaryotic expression vector containing HSVtk gene under the control of hTERT core promoter was constructed and was transfected into cervical carcinoma cells(HeLa) and vessel endothelial cells(ECV304) by liposome method. Transfected cells were then selected with G418 and RTPCR was used to detect the tk gene expression in HeLa cells and ECV304 cells. After GCV was added, flow cytometry method were applied to investigate its cell killing effect. RESULTS: pCIneo/hTERTtk/GCV system under the control of hTERT induced the apoptosis in more than 36.7% of cervical carcinoma cells, but not in normal vessel endothelial cells. CONCLUSION: hTERT gene core promoter is tumorspecific and may be useful in tk gene therapy of cervical carcinoma and in reducing the side effects of the therapy.
【Keywords】 telomerase; promoter regions (genetics); cervix neoplasms; tk gene
【摘要】目的： 研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦（HSVtk/GCV）系统对宫颈癌细胞的体外杀伤作用.方法： 构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pCIneo/hTERTtk，分别用脂质体法转染宫颈癌细胞(HeLa)和正常血管内皮细胞（ECV304），新霉素（G418）筛选阳性克隆扩增. 用RTPCR法比较两种细胞tk基因的表达情况；给予前药更昔洛韦（GCV），用流式细胞术检测hTERT调控的HSVtk/GCV系统对两种细胞的杀伤作用. 结果： hTERT启动子调控下的HSVtk/GCV系统对宫颈癌HeLa细胞有明显的杀伤作用，使36.7%的细胞凋亡；而对正常细胞ECV304作用则不明显. 结论： hTERT启动子调控的tk基因是一种具有肿瘤特异性的治疗方法，有望解决肿瘤基因治疗中的特异性杀伤及降低毒副作用等问题.
【关键词】 端粒，末端转移酶；启动区（遗传学）；宫颈肿瘤；tk基因
0引言
宫颈癌是死亡率较高的恶性肿瘤,传统治疗方法以手术、化疗、放疗为主,但晚期不宜手术者及对放化疗不敏感者5 a生存率仍不理想. 随着分子生物学及相关技术的迅速,自杀基因疗法在肿瘤治疗中取得了一定疗效，其利用人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦（human simplex virusthymidine kinase/ganciclovir, HSVtk/GCV）将更昔洛韦（ganciclovir, GCV）等前药磷酸化为细胞毒产物,从而阻止细胞DNA合成, 杀伤肿瘤细胞［1-2］. 有研究发现，由于缺乏特异性，tk基因修饰的正常组织细胞经前药治疗后会与肿瘤细胞一起被杀死，造成对正常组织的杀伤. hTERT基因在90%的人类肿瘤组织中呈过表达［3］，具有明显的肿瘤特异性.我们采用克隆hTERT基因启动子，利用其在肿瘤细胞中特有的启动活性来控制HSVtk的肿瘤特异性表达的方法，旨在实现其在肿瘤细胞中的特异性杀伤作用.
1材料和方法
1.1材料Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶以及电泳中所用marker DL2000和DGL2000均购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自日本Promega公司；质粒提取、纯化试剂盒购自北京天为时代公司；转染试剂盒LipofectamineTM2000购自美国Introvigen公司；含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因与tk基因的pGL3 Basic质粒由第四军医大学唐都耳鼻喉科韩明鲲馈赠；pCIneo质粒由第四军医大学唐都医院肾内科杨洁馈赠；GCV购自广东丽珠集团；大肠杆菌菌株JM109，宫颈癌细胞HeLa和脐静脉内皮细胞ECV304均由第四军医大学唐都医院临床实验科提供；流式细胞仪美国Coulter公司.
1.2方法
1.2.1hTERT基因启动子引物的设计和合成设计hTERT基因启动子引物的酶切位点为BglⅡ和HindⅢ,由上海基康生物工程公司合成. 上游引物： 5′ggg aga tct agt gga ttc gcg ggc aga ga 3′；下游引物： 5′ggg aag ctt agg gct tcc cac gtg cgc ag3′.以含有hTERT启动子的质粒为模板进行PCR扩增，循环参数为： 94℃ 2 min; 94℃ 30 s, 67℃ 30 s, 72℃ 40 s, 30个循环；72℃ 1 min. PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收得到hTERT启动子片断.
1.2.2质粒的构建将获得的hTERT片断以BglⅡ和HindⅢ双酶切，得到两端为BglⅡ和HindⅢ位点的hTERT启动子片断，将其连接入pGL3tk质粒相应的酶切位点之间，得到含有hTERTtk基因的质粒pGL3. 将以上质粒用BglⅡ和XbaⅠ双酶切，得到hTERTtk基因片断，将其连入pCIneo质粒相应的酶切位点之间，得到hTERT启动子调控的tk基因真核表达载体pCIneo/hTERTtk，并以酶切方法进行鉴定.
1.2.3质粒的转染复苏HeLa细胞与ECV304细胞，培养在含100 mL/L新生牛血清的达尔伯克氏必需基本培养基（DMEM）中. 转染前1 d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在2 mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养液中(每孔3×105细胞)，使其在转染日能达到80%的覆盖率. 每种细胞接种2个孔，分别转染pCIneo/hTERTtk和pCIneo两种质粒,分别命名为HeLa/hTERTtk， HeLa/0，ECV304/hTERTtk以及ECV304/0. 对于每孔细胞，每10 uL脂质体中加入4 μg DNA，以无血清DMEM培养液混匀，37℃，50 mL/L CO2中孵育5 h，更换含血清培养液继续孵育24 h，改用含G418的培养基培养，G418浓度为500 μg/mL，持续筛选12 d后挑出单克隆，扩大培养. 期间每3 d换液1次，得到稳定转染了两种质粒的细胞.
1.2.4RTPCR分别提取转染的HeLa和ECV304细胞基因组总RNA，常规方法反转录cDNA，并以此为模板进行tk基因核心序列的PCR扩增. 上游引物： 5′gca tgg ctt cgt acc cct gcc atc3′；下游引物： 5′gcg tta gcc tcc ccc atc tcc cgg3′. 循环参数为： 94℃ 3 min；94℃ 40 s, 60℃ 40 s, 72℃ 70 s,30个循环；72℃ 8 min. PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳0.5 h，紫外灯下摄片.
1.2.5流式细胞仪检测不同载体转染的不同细胞命名为： HeLa/hTERTtk, HeLa/0, ECV304/hTERTtk和ECV304/0，分别按2×105的数量接种于25 cm2培养瓶中，37℃, 50 mL/L CO2孵箱孵育24 h后换GCV(1 mg/mL)培养液，继续孵育72 h后收集1×106个细胞，先用PBS洗涤2次，再用无水乙醇固定，送流式细胞仪进行分析，每种细胞送5份. 检测前离心去乙醇,碘化丙皖染色15 min. 汞激光激发波长为488 nm, 结果用软件Elite 4.0和DNA Multictycle分析.
统计学处理： 数据以x±s表示，用SPSS11.0软件进行统计分析，多个样本均数比较用方差分析；两两均数之间比较用SNKq检验. P<0.01为有统计学意义.
2结果
2.1表达载体的酶切鉴定在重组质粒pCIneo/hTERTtk中，选择tk基因片断两端的NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点进行双酶切，电泳分离，出现与tk基因大小相符的约为1100 bp的条带（图1）; 选择hTERT启动子片断两端的BglⅡ和HindⅢ酶切位点进行双酶切，电泳分离，出现与hTERT基因大小相符的约为280 bp的条带（图2）.
2.2HeLa与ECV304转染后tk基因表达检测通过RTPCR后电泳分析，HeLa细胞转染pCIneo/hTERTtk质粒后可检测到tk基因的表达，而ECV304转染相同质粒后则无tk基因的表达（图3）.
2.3细胞凋亡率与细胞周期流式细胞仪检测结果显示，HeLa/hTERTtk细胞的凋亡率为36.7%，明显高于转染不含tk基因质粒的细胞（HeLa/0）的凋亡率2.9% （P<0.01）. HeLa/hTERTtk细胞S期所占比例为11.9%，明显少于HeLa/0细胞S期所占比例35.9%(P<0.01）. ECV304细胞转染两种质粒相比，凋亡率与S期比例均无显著差异(P>0.05,表1).表1四种细胞凋亡率及细胞周期的比较
3讨论
近年来研究表明，人端粒酶由三部分组成： RNA亚单位（human telomerase RNA, hTR）,蛋白质亚单位（human telomerase associated protein 1, hTEP 1）［4］和hTERT. 其中hTERT被认为是决定端粒酶活性的重要部分［5-6］. 在以上三个亚单位中，hTR和hTEP 1在肿瘤和正常组织中均广泛表达，而hTERT的表达却大多分布在恶性肿瘤组织中，在正常组织中少见. Koga等［7］和Gu等［8］构建了由hTERT 启动子调控的、携带有胱天蛋白酶和Bax等凋亡诱导基因的靶向基因载体, 可诱导端粒酶表达阳性的肿瘤细胞发生凋亡［9］, 凋亡率可达到40%～84%; 而对正常人体细胞几乎没有影响；Liu等［10］也发现利用hTERT启动子诱导CD基因可特异性杀伤大肠癌细胞，并增强其前体药物5Fu对大肠癌细胞的敏感性. 因此，利用端粒酶逆转录酶启动子构建癌细胞特异性表达载体用于基因治疗是一种较理想的选择.
在实验中我们观察到，宫颈癌细胞中tk基因的表达可以将前药GCV转换为细胞毒性产物而对细胞产生杀伤效应. 细胞周期分析表明，经GCV处理后的宫颈癌细胞，细胞碎片比例明显增加，S期细胞所占比例明显减少，而S期为细胞的DNA合成期，期间主要为细胞DNA的合成与复制. 由此我们推断，hTERT启动子调控的HSVtk/GCV系统可能是通过抑止癌细胞DNA的合成和复制导致细胞凋亡.
我们还发现，RTPCR与细胞周期分析结果都显示，只有在端粒酶表达阳性的肿瘤细胞中，hTERT启动子才能发挥作用使tk基因得到表达；同样只有在肿瘤细胞中，得到表达的tk基因产生的tk酶才可将GCV转化为细胞毒性物质，抑止DNA的合成导致细胞凋亡. 而在正常细胞中，无论是转染前还是转染后，均无法引起明显的细胞的凋亡. 这表明hTERT启动子调控的HSVtk/GCV系统仅特异作用于肿瘤细胞，成功的实现了肿瘤基因治疗的特异性.
【】
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