HBV全基因组克隆转染细胞系的建立

【关键词】  肝炎病毒,乙型；基因组,病毒；克隆,分子；转染；细胞培养；基因表达

    【Abstract】 AIM: To construct a new cell culture system for producing HBV in vitro.METHODS: Fulllength HBV DNA was cloned into pcDNA3 vector (named pcDNA33HBV). HepG2 cells were transfected with pcDNA33HBV and screened with antibiotic G418. HBsAg and HBeAg were identified by ELISA and HBcAg was identified by immunocytochemical staining. S gene mRNA expression was tested by RTPCR and HBV DNA in the supernatant of transfected cells was tested by PCR. RESULTS: The plasmid pcDNA33HBV was constructed successfully. After stable transfection, HBsAg and HBeAg could be detected in the supernatant of transfected cells. HBcAg positive staining was located mainly in the cytoplasm. S gene mRNA expression was verified. S gene and preS gene could be detected in the supernatant by RTPCR. The copies of HBV genome can reach 1×108 copies/L detected by realtime quantitative PCR. CONCLUSION: Recombinant plasmid pcDNA33HBV could be expressed, transcribed and replicated in HepG2 cells. This transfectionbased cell culture system could produce high copies of HBV genome.

    【Keywords】 hepatitis B virus; genome, viral; cloning, moleculor; transfection; cell culture;  gene expression

    【摘要】 目的： 建立HBV体外细胞培养体系. 方法： 构建HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV，稳定转染HepG2细胞，G418筛选. ELISA检测细胞上清液HBsAg，HBeAg的表达，免疫组化检测细胞内HBcAg的表达，RTPCR检测细胞S基因mRNA的表达，PCR检测细胞上清液DNA. 结果： 成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV，稳定转染HepG2后，培养上清HBsAg，HBeAg阳性，细胞内HBcAg呈核浆型分布，且以浆型分布为主. RTPCR证实有HBV S基因 mRNA 的表达，上清中HBV S及前S基因阳性，荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV 滴度达1×108拷贝/L. 结论： 重组质粒pcDNA33HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制，该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.

    【关键词】 肝炎病毒，乙型；基因组，病毒；克隆，分子；转染；细胞培养；基因表达

      0引言

    由于HBV宿主范围窄、动物模型缺乏，体外组织培养也一直没有太大进展，且不能在体外人工培养，制约了对HBV的研究［1］. 将HBV DNA转移至靶细胞，建立表达HBV的体外培养细胞模型对研究HBV生物学特性和肝炎发病机制有重要意义［2-4］. HBV基因组呈双链闭合环状，基因结构紧凑，其开放读框分布于全长DNA，为使完整的转染基因能在细胞内复制，目的基因的长度要大于一个HBV DNA单元［5-6］. 我们构建3倍HBV基因的重组真核表达质粒，转染细胞，以筛选获得稳定表达病毒蛋白的细胞模型，并研究其产生HBV的水平.

    1材料和方法

    1.1材料HBV全基因亚克隆载体pUC193HBV为pUC19在EcoRⅠ及HindⅢ位点中插入头尾相连的HBV（adr亚型）三连体，由山东大学医学院免疫学研究所张秋博士惠赠，保存在大肠杆菌DH5α中. 真核细胞表达载体pcDNA3由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室赵晶博士惠赠；人肝母细胞瘤细胞系（HepG2）由第四军医大学微生物学教研室惠赠，本室传代培养；内切酶EcoRⅠ, HindⅢ, T4 DNA连接酶,Taq DNA聚合酶,反转录酶及DNA marker（TakaRa公司）；质粒提取试剂盒（西安市莱博科技有限公司）；LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）；DMEM培养基，G418（Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；ELISA检测试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司）；SABC免疫组化试剂盒，DAB染色剂（武汉博士德生物工程有限公司）；S基因，βactin 及HBV 前S/S基因引物均由北京赛百胜公司合成.

    1.2方法

    1.2.1pUC193HBV和pcDNA3的酶切鉴定及目的基因片段的获得过夜培养 pUC193HBV和pcDNA3，以质粒提取试剂盒抽提制备pUC193HBV和pcDNA3，分别以EcoRⅠ, HindⅢ单酶切pUC193HBV，以EcoRⅠ, HindⅢ双酶切pUC193HBV和pcDNA3，琼脂糖凝胶电泳分离目的基因，利用胶回收试剂盒回收9600 bp HBV全长基因片段和线性pcDNA3.

    1.2.2pcDNA33HBV重组质粒的构建及鉴定HBV DNA与 线性pcDNA3以浓度比3∶1混合，在T4 DNA连接酶作用下4℃连接16 h. 连接产物转化感受态细胞DH5α. 随机调取抗性菌落，经小量扩增，提取质粒，分别以EcoRⅠ, HindⅢ单酶切并以二者双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京三博远志生物技术有限公司进行序列测定.

    1.2.3脂质体介导下pcDNA33HBV基因转染转染前一日将处于对数生长期的HepG2细胞用胰酶消化并换无抗生素的DMEM培养基，将细胞接种于24孔板，密度达90%时进行转染. 转染方法按说明书进行. 24 h后传代，48 h换含600  mg/L G418培养基进行筛选. 设未转染的HepG2细胞为对照. 待对照组细胞全部死亡后，用含300 mg/L G418的培养基维持. 筛选过程不含其他抗生素.

    1.2.4ELISA测抗原表达取转染细胞的上清液用ELISA法测HBsAg，HBeAg. 操作及结果判定按ELISA试剂盒说明书进行，终止反应后10 min内用酶标仪检测A450 nm值.

    1.2.5SABC染色法检测细胞中HBcAg的表达Triton X100处理，封闭非特异性抗原反应，依次加入一抗（兔抗人HBc mAb）、生物素化的二抗（羊抗兔IgG）和SABC复合物，DAB显色，脱水透明，封片观察.

    1.2.6RTPCR检测细胞中S基因mRNA的表达提取细胞总RNA，反转录为cDNA, 以βactin (sense: 5′CCCAGATCATGTTTGAGACC 3′; antisense: 5′TAGCTCTTCTCCAGGGAGGA3′）为内参照，扩增片段长度为361 bp.  以S基因引物（sense: 5′CTGCTGGTGGCTCCAGTT 3′; antisense: 5′CAATACCACATCATCCAT 3′）做PCR反应,扩增产物为500 bp. 反应条件为94℃预变性5 min 后开始循环,94℃ 50 s, 55℃ 50 s, 72℃ 55 s，共30个循环,最后72℃延伸5 min. 琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物.

    1.2.7PCR检测培养上清中DNA收集转染细胞上清，提取DNA，以针对HBV前S/S基因的引物(sense: 5′CGGGATCCCATATTCTTGGGAACAAG3′; antisense:  5′CACTGCAGGGTTTAAATGTATACCCA3′) PCR，扩增片段长度为1200 bp，反应条件为94℃预变性5 min后开始循环，94℃ 45 s, 55℃ 1 min, 72℃  2 min, 共35个循环，最后72℃延伸5 min. 设质粒pUC193HBV为阳性对照.

    1.2.8荧光定量PCR检测上清中DNA滴度取转染后48 h、转染后1 mo及转染后3 mo的细胞上清液（经PCR检测DNA阳性）送第四军医大学西京临床免疫科，做荧光定量PCR检测HBV DNA滴度. 操作步骤按乙型肝炎核酸扩增荧光检测试剂盒说明书进行. 结果判定为HBV DNA滴度>1×106拷贝/L为阳性，否则为阴性.