PCNA和MMP9在宫颈癌组织中的表达与意义

              作者：孙红，王浩，秦天洁，阮之平，马瑾璐

【关键词】  宫颈肿瘤;增殖细胞核抗原；明胶酶B；免疫组织化学

　　Expressions and significance of PCNA and MMP9 in cervix cancer tissue

　　【Abstract】  AIM: To investigate the expressions of PCNA and MMP9 in cervix cancer tissue and their significance. METHODS:  The immunohistochemical SP staining method was used to evaluate the PCNA and MMP9 expressions in 46 cases of cervix cancer tissues and 10 cases of normal cervix tissues. RESULTS:  The expression of PCNA in cervix cancer tissues was much higher than that in normal cervix tissues (P=0.000)；The positive rate of MMP9 protein 82.61% in  46 cases of cervix cancer was significantly higher than that in 10 cases of normal cervix (30%,  P<0.05). There was a positive correlation between PCNA and MMP9 expressions (rs=0.433,  P=0.003). The expressions of PCNA and MMP9 were correlated with the clinical stage (P<0.05), but not with age, pathological stage or growth pattern (P>0.05). CONCLUSION: The overexpression of MMP9 has a close relationship with the cell proliferation index in cervix cancer, suggesting that MMP9 may play an important role in the development of cervix cancer.

　　【Keywords】 cervix  neoplasms; proliferating cell nuclear antigen (PCNA); gelatinase B; immunohistochemistry

　　【摘要】 目的： 探讨PCNA，MMP9在宫颈癌组织中的表达及临床意义. 方法： 用免疫组织化学SP法检测46例宫颈癌及10例正常宫颈中PCNA和MMP9的表达，分析不同组织中PCNA和MMP9表达的差异及两者的相关性. 结果： 宫颈癌组织PCNA的表达明显高于正常宫颈组织(P=0.000)；38例宫颈癌的MMP9阳性表达（82.61%）明显高于10例正常宫颈组织的表达(30%， P0.05)；PCNA的表达与MMP9的表达呈正相关（rs=0.433, P=0.003），且PCNA和MMP9均与临床分期有关（P0.05），而与年龄、病例分级及生长方式无关（P0.05）. 结论： MMP9在宫颈癌组织中表达异常增高，与细胞增殖关系密切，提示其对宫颈癌的起重要作用.
 
　　【关键词】  宫颈肿瘤;增殖细胞核抗原；明胶酶B；免疫组织化学

　　0引言

　　宫颈癌是最常见的女性生殖系统肿瘤，其局部侵袭力强，易直接蔓延和经过淋巴道转移. 从原位癌增殖到侵袭转移癌的演进过程,一方面依赖于肿瘤细胞本身的恶性潜能，另一方面是其实质与间质之间相互作用的结果. 增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）是DNA聚合酶的辅助因子，能反映细胞增殖活性 . 基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases9, MMP9)属于基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）家族成员，能降解Ⅰ, Ⅳ,Ⅴ型胶原及纤维粘连蛋白等基底膜和细胞外基质成分，从而促进恶性肿瘤的浸润、转移及间质血管新生；而间质血管新生则为肿瘤组织提供营养并排出其废物，使肿瘤得以持续迅速生长和发生浸润转移 . 为进一步探讨宫颈癌发生、发展的机理，我们应用免疫组织化学SP法检测不同宫颈组织中MMP9和PCNA基因的表达，并讨论其临床意义.

　　1对象和方法

　　1.1对象200501/200602收治经病理确诊的活检标本，年龄27~70（平均48.6）岁. 46例宫颈癌浸润癌按国际妇产科联盟（FIGO， 1995）修订的宫颈癌临床分期标准，Ⅱ期28例，(60.9%)，Ⅲ期18例(39.1%). 按WHO病理分级标准分级：G16例(13.0%)；G228例(60.9%)；G312例(26.1%). 高、中、低分化相当于病理分级1～3级. 常规40 g/L甲醛固定、石蜡包埋，切片厚4~5 μm. 以10例正常宫颈组织作对照.
 
　　1.2方法鼠抗人MMP9抗体、小鼠抗大鼠PCNA抗体及通用型SP 9000试剂盒，山羊血清，生物素标记的二抗，抗辣根过氧化物酶标记的链霉素抗生素，二氨基联苯胺显色液购自武汉博士德生物技术有限公司产品. 一抗稀释度均为1∶30. MMP9和PCNA的免疫组织化学染色法按说明书进行操作，采用链霉素抗生物素蛋白过氧化酶免疫染色（SP）法进行免疫组织化学染色，切片常规脱蜡水化后，于柠檬酸缓冲液中煮沸10 min，保温10 min作抗原修复；PBS冲洗后山羊血清工作液孵育，滴加一抗37℃孵育2 h, PBS冲洗3次. 滴加二抗，PBS冲洗3次. 滴加三抗，孵育，PBS冲洗3次，DAB显色，复染、脱水、透明、封片后镜下观察. 一抗以PBS为阴性对照.

　　PCNA以胞核出现棕黄色颗粒或棕褐色颗粒为阳性细胞，对每例切片进行细胞计数,随机取10个视野，记阳性细胞总数，用标记指数LI表示，即LI(%)＝（阳性细胞数/计数细胞）100，取平均值定义为肿瘤的PCNA的LI［3］. MMP9蛋白定位于细胞质，阳性结果以胞质内出现黄色为准. 结果判定采用半定量积分法［4］，并根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅计分，着色细胞比例1p3以下为1分；1p3 ~2p3为2分 ；2p3以上为3分. 着色深度：无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分. 根据两者的乘积判断阳性等级：0分为（-）；1~2分为（+）;3~4分为（） ；>4分为（）.
 
　　统计学处理： 实验结果采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，各指标间的相关采用Spearman相关分析法，两组间均数比较采用t检验, 两组间表达率比较采用χ2检验，P<0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1PCNA蛋白表达PCNA免疫组化阳性细胞为胞核着色，46例宫颈组织中均有不同程度PCNA的阳性表达，PCNA标记指数为4.00%～71.06%，在中、晚期恶性肿瘤组织中PCNA的表达差异有统计学意义（P<0.05）,分化程度越差，PCNA表达越高，但没有统计学差异. 而PCNA的表达与年龄、生长方式无明显相关性. 正常宫颈组织见PCNA极微弱阳性染色,10例正常组织PCNA标记指数不足5%（表1）.

　　2.2MMP9蛋白表达MMP9免疫组化阳性的表达主要位于细胞的胞质和细胞膜，肿瘤细胞间质均呈均质性的弱阳性反应. MMP9阳性的癌细胞均呈灶状或片状分布，且多位于癌边缘. 宫颈癌组织多呈阳性、中度阳性表达. 正常宫颈组织MMP9表达多为阴性或弱阳性. MMP9在宫颈癌的表达率为82.61%，不同年龄组中的表达分别为87.50%（<49岁），72.72%（≥49岁）；在中、晚期患者中的表达分别为71.42%和100.00%；在低分化及中高分化的表达分别为83.33%，82.35%；在菜花型和结节型生长方式中的表达分别为93.75%，57.14%，其中在中、晚期患者中的表达有统计学意义（P<0.05），与其余各项临床病理参数均无统计学意义. 46例宫颈癌组织中两者表达阳性者38例（82.61%），呈正相关（rs =0.433, P=0.003）.

　　表146例患者PCNA和MMMP9的表达（略）

　　aP<0.05 vs Ⅱ期.

　　3讨论

　　宫颈癌的发生和是多基因、多因素及分子水平多阶段的过程. 目前宫颈癌的发病率有上升趋势，尤其年轻宫颈癌发生率上升趋势更加明显［5］. 增殖、浸润和转移是恶性肿瘤主要的生物学特征，也是影响效果和预后的主要因素.
 
　　PCNA是DNA聚合酶的辅助因子，属于一种酸性核蛋白，参与DNA的合成并在细胞周期中起重要的调控作用. PCNA在DNA的合成的G1期开始增加，至S期达到高峰，G2/M期迅速降低. 这种变化恰好与细胞增殖周期过程相关. 由于PCNA的合成与表达和细胞增殖活性密切相关，因此检测PCNA可以反映癌细胞DNA的合成情况，为癌细胞增殖活性提供客观指标. PCNA不仅在DNA复制中起关键作用，而且许多细胞内外增殖信号都须经过PCNA的参与，才能引发细胞DNA合成及分裂增殖［6］. 研究发现，PCNA与许多恶性肿瘤如脑星形细胞瘤、宫颈癌、肝癌、乳腺癌等地病理分级、临床分期及淋巴结或脏器转移有关，并可用于临床诊断、指导治疗以及预后评估. 本研究发现宫颈癌患者PCNALI与正常宫颈组相比有显著性差异（P<0.05），说明宫颈癌细胞有生长调节失控、DNA合成紊乱现象. 细胞的异常增殖对肿瘤的发生发展起了重要作用，而与增殖相关基因的异常表达恰恰解释了细胞的异常增殖. 本研究中PCNA的阳性表达与宫颈癌的浸润深度有关，分期越晚PCNA的表达越高. 这提示宫颈癌一旦浸润转移后，癌细胞增殖活性大大增加，恶性程度明显增高. 本研究发现分化程度越低，PCNA的表达越高，这与报道肿瘤细胞的分化程度越低，增殖指数增高，恶性越高相一致，但本研究未发现具有显著性差异，可能与病例数较少有关.
 
　　基质金属蛋白酶(MMPs)活性与肿瘤浸润转移能力之间有着密切的关系. 肿瘤新生血管的形成过程中包括毛细血管内皮下层基底膜降解，内皮细胞迁移和增殖、新生血管形成和新的基底膜形成等一系列过程［7］. MMP9是MMPs中分子量最大的酶，是一类分解细胞外基质组分的锌蛋白酶,它以酶原的形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶. 一方面降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质和血管壁的基底膜，促进肿瘤侵袭和转移，另一方面则通过毛细血管内生、新生血管生成促进肿瘤侵袭和转移. 基质蛋白酶是高度保守的一类酶，可以特异降解肿瘤细胞外基质中的一种或几种蛋白质，故可以降解所有的细胞外基质，由此MMPS降解细胞外基质是肿瘤细胞向瘤灶周围侵袭性生长的关键事件［8］. 本研究发现在增长正常组织中MMP9呈低水平表达或阴性表达，而在肿瘤组织中呈阳性表达，且MMP9的表达量在两者中有显著差异（P<0.05）.

　　本研究发现PCNA, MMP9在宫颈癌组织中的表达中随着病理分期越高表达指数明显增高. 有关文献报道癌细胞MMP9表达增强与其增殖指数的增加有关，MMP9表达细胞增殖指数明显高于阴性对照组，提示MMP9具有促进细胞增殖功能. PCNA蛋白检测可直接反映细胞合成代谢及增殖状态 . 而MMP9基因调控主要在转录水平，多种MMP基因的增强子区域有高度的调控元件的保守性，由生长因子、细胞因子和环境因素诱导表达. 宫颈癌组织中MMP9表达与正常组织相比明显增高，与细胞增殖关系密切，提示MMP9基因的激活可能通过促进肿瘤细胞增殖，以及降解细胞外基质和血管壁的基底膜促进肿瘤的发生发展. 可以推测，两者表达的宫颈癌细胞中，PCNA促进细胞的大量增殖，而MMP9能够破坏细胞外基质，提供癌细胞的发展空间和转移通道，两者相互协同，可能造成了宫颈癌易复发转移的特征. 针对二者的靶向治疗，则有可能阻断宫颈癌的进程. 有关MMP9与PCNA对宫颈癌预后的关系需做进一步随访研究.

　　【文献】

　　［1］ FernandezSanchez M, GamboaDominguez A, Uribe N, et al. Clinical and pathological predictors of the response to neoadjuvant anthracycline chemotherapy in locally advanced breast cancer ［J］. Med Oncol, 2006,23(2):171-183.

　　［2］ Rytkonen AK, Vaara M, Nethanel T, et al. Distinctive activities of DNA polymerases during human DNA replication ［J］. FEBS J,2006,273(13):2984-3001.

　　［3］ Nair A, Venkatraman M, Maliekal TT, et al. NFkβ is constitutively activated in high grade squamous in traeoithelial lesions and squamous cell carcinomas of the huaman uterine cervix ［J］. Oncogene, 2003,22(2):50-80.

　　［4］ 牟晓燕, 李怀臣,韩俊庆. MMP2和MMP9在非小细胞肺癌组织中的表达［J］. 山东医药, 2004,44(25):7-8.

　　［5］ Parkin DM. Global cancer statistics in the year 2000［J］. Lancet Oncol, 2001,2(9):533-543.

　　［6］ Taftachi R, Ayhan A, Ekici S, et al. Proliferatingcell nuclear antigen (PCNA) as an independent prognostic marker in patients after prostatectomv: a comparison of PCNA and Ki67［J］. BJU Int, 2005,95(4):650-654.

　　［7］ Morgan H, Hill PA. Human breast cancer cellmediated bone collagen degradation requires plasminogen activation and matrix metalloproteinase activity ［J］. Cancer Cell Int, 2005,5(1):1-5.

　　［8］ 何茵芳,吴智玉,韩钦玮.卵巢上皮癌PTEN和PCNA的表达［J］.第四军医大学学报,2005,26(19):1808-1810.