NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人Miapaca

【关键词】  NT4p53(C22)Ant；重组腺伴病毒；胰腺肿瘤；细胞系

　　Killing effects of  recombinant AAV expressing fusion peptide NT4p53(C22)Ant on human pancreatic cancer MiapacaⅡcells

　　【Abstract】 AIM:  To study the killing effects of recombinant adenoassociated virus(AAV) expressing fusion peptide NT4p53(C22)Ant on human pancreatic cancer MiapacaⅡ cells. METHODS:  NT4p53(C22)Ant was constructed and subcloned into the vector of recombinant AAV, and that was amplified in 293 packaging cells. The recombinant plasmid AAVNT4p53(C22)Ant was transferred into MiapacaⅡ cells. The direct effects on human pancreatic cancer cell line MiapacaⅡ were detected with light microscope, MTT, flow cytometry and lactate dehydrogenase(LDH) release assay. RESULTS: It could be observed under microscope that the AAVNT4p53(C22)Ant could directly kill the MiapacaⅡcells. MTT revealed that the survival rate of the cells was decreased obviously. Flow cytometry showed that the number of apoptotic cells was significantly increased in AAV NT4p53(C22)Ant group as compared with control group and simple AAV group (P<0.05). LDH level went up a little (P>0.05). CONCLUSION: The AAVNT4p53(C22)Ant could cause the apoptosis of human pancreatic cancer MiapacaⅡcells to kill the cells directly.

　　【Keywords】 NT4p53(C22)Ant; recombinant adenoassociated virus (rAAV); pancreatic neoplasms;  cell line

　　【摘要】 目的： 研究NT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对人MiapacaⅡ胰腺癌细胞杀伤作用. 方法： 构建NT4p53(C22)Ant，将其亚克隆于腺伴病毒载体中，经293细胞包装、扩增构成具有感染性的重组腺伴病毒AAVNT4p53(C22)Ant，转染人胰腺癌MiapacaⅡ细胞，经光镜下观察、MTT比色试验、PI染色实验及乳酸脱氢酶释放检测(LDH)，观察AAVNT4p53(C22)Ant对细胞的杀伤作用. 结果： 光镜下可见随AAVNT4p53(C22)Ant感染MiapacaⅡ细胞时间延长，肿瘤细胞数目明显减少；MTT实验检测发现细胞存活率明显降低(P<0.05)；流式细胞检测凋亡细胞数目较对照组及空病毒组增加(P<0.05)；LDH检测培养基中LDH只有轻度增加(P>0.05). 结论： 重组腺伴病毒NT4p53(C22)Ant对胰腺癌细胞有杀伤作用，并且是通过引起细胞凋亡而实现的.

　　【关键词】 NT4p53(C22)Ant；重组腺伴病毒；胰腺肿瘤；细胞系

　　0引言

　　胰腺癌的发生与多种基因异常有关，其中p53基因最受瞩目，这是因为70%的胰腺癌患者均有p53的突变. 研究表明，野生型p53基因与细胞周期生长调节、细胞转化的调节、DNA复制以及诱导细胞程序性死亡有密切关系，腺病毒介导的天然p53可以抑制人胰腺癌肿瘤组织的生长并可诱导发生细胞凋亡. 在多种肿瘤细胞中，p53蛋白由于突变而失活或由于其他原因而受限，恢复其功能是肿瘤研究中的重要目标［1］，但是近年来研究者已经阐明直接向肿瘤细胞内转导野生性p53的抗癌作用是有限的［2］，因此抑制p53的降解和挽救突变的p53来肿瘤成为了新的研究热点.

　　1材料和方法

　　1.1材料pGEMT Easy质粒购自Promega公司；pBV220NT4质粒、腺伴病毒载体pSSHGCMV由西安华广生物工程有限公司提供；293细胞(人胚肾细胞)美国ATCC公司产品，西安华广生物公司复苏传代；RPMI1640培养基购自华美生物工程公司；MiapacaⅡ细胞株由吕毅教授馈赠；DMEM购自美国Gibco公司；MTT试剂购自华美生物工程公司；PI试剂购自Sigma公司；LDH试剂盒购自宝灵曼公司.
 
　　1.2方法

　　1.2.1构建AAVNT4p53(C22)Ant① 采用非对称引物/模板法，根据GenBank提供的人p53 361382位氨基酸cDNA序列及果蝇同源框序列4358位氨基酸的cDNA，设计正、负向引物/模板链，PCR扩增目的基因片段，回收的目的基因片段连接于pGEMTeasy载体，质粒转化细菌，阳性克隆筛选、酶切鉴定、序列测定正确后，大量制备酶切回收p53(C22)Ant片段；② 连接于pBV220NT4质粒，转化细菌，阳性克隆筛选、酶切鉴定、序列测定分析正确后，大量制备重组质粒pBV220/NT4p53(C22)Ant，回收NT4p53(C22)Ant目的cDNA片段；③ 亚克隆于腺伴病毒载体中，经293细胞包装、扩增、纯化及滴度测定构成具有感染性的重组腺伴病毒AAVNT4p53(C22)Ant.
 
　　1.2.2重组腺伴病毒感染MiapacaⅡ细胞① 复苏MiapacaⅡ(p53变异)细胞株，挑选50%融合的细胞10瓶，每瓶细胞数约为10×105个，100 mL细胞瓶面积为30 cm2；② 分别以AAVNT4p53(C22)Ant(1×1010 pfu/次)，AAV空病毒（1×1010 pfu/次）感染MiapacaⅡ细胞；③ AAVNT4p53(C22)Ant和AAV空病毒感染的细胞在37℃  50 mL/L CO2湿化室中孵育2 h，移去感染液，加入含新鲜血清的DMEM，然后继续孵育至96 h，此间每24 h换1次培养基.
 
　　1.2.3AAVNT4p53(C22)Ant对胰腺癌MiapacaⅡ细胞的杀伤作用① 于转染24， 48， 72 h分别收集转染后MiapacaⅡ细胞及其培养基，光镜下观察MiapacaⅡ细胞的形态变化，连续观察72 h，记录并拍片；② MTT比色试验：以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL，每孔加入MTT试剂(5 g/L) 20 μL，37℃继续培养4 h，终止培养，吸去上清液，再加入DMSO(二甲基亚砜)150 μL，摇匀15 min，使反应产物充分溶解，在发射波长为490 nm的酶标仪进行测定. 细胞存活率PR=T/C×100%，其中T为处理孔A490 nm，C为对照孔A490 nm；③ PI染色, 流式细胞仪检测细胞凋亡、坏死情况； ④ 乳酸脱氢酶(LDH)释放的测定，LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2, 4－二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力，通过对LDH测定可观察AAVNT4p53(C22)Ant对细胞的杀伤作用.
     
　　统计学处理： 实验结果以x±s表示，统计分析采用SPSS10.0统计软件进行方差分析和LSDt检验，P<0.05认为有显著性差异.

　　2结果

　　2.1MiapacaⅡ细胞的形态变化AAVNT4p53(C22)Ant感染MiapacaⅡ细胞后24～72 h，光镜下连续观察到细胞皱缩，细胞间隙增宽，界限模糊，并随时间延长，肿瘤细胞明显减少. 不处理或用空病毒感染MiapacaⅡ细胞，发现细胞形态无明显变化(图1).

　　2.2AAVNT4p53(C22)Ant对MiapacaⅡ细胞的杀伤作用AAVNT4p53(C22)Ant感染MiapacaⅡ细胞24, 48, 72 h，细胞存活率随作用时间延长逐渐降低，分别为24.4%, 21.5%, 14.0%，与AAV空病毒组（30.8%， 72.7%， 95.3%）及未处理对照组（34.3%， 77.9%， 100%）比较，48 h及72 h均有统计学差异(P<0.05).

　　A: 未处理48 h;  B: AAVNT4p53(C22)Ant治疗48 h;C: 未处理72 h; D: AAVNT4p53(C22)Ant 治疗72 h.

　　图1AAVNT4p53(C22)Ant 感染MiapacaⅡ细胞的形态变化×200（略）

　　2.3PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡 PI染色流式细胞仪检测发现AAVNT4p53(C22)Ant转染MiapacaⅡ细胞24 h后，未处理组凋亡细胞占(0.21±0.02)%，空病毒组凋亡细胞占(0.25±0.03)%，治疗组凋亡细胞占(3.93±0.22)%，说明AAVNT4p53(C22)Ant治疗MiapacaⅡ细胞24 h后凋亡细胞增多，与未处理对照组及空病毒组比较有统计学差异(P<0.05).

 
　　2.4LDH释放的测定随着AAVNT4p53(C22)Ant对MiapacaⅡ转染时间的增加，培养基中LDH逐渐增加，但与空病毒组及未处理对照组间无差异(P>0.05，表1）.

　　表1AAVNT4p53(C22)Ant转染MiapacaⅡ后LDH释放量（略）

　　3讨论

　　随着对p53蛋白的结构区的研究，发现p53氨基端肽及p53羧基端肽在体外对人的肿瘤细胞均有明显抑制作用［3］，但它们的抗肿瘤机制不同. p53氨基端肽形成的S螺旋结构，可直接导致肿瘤细胞坏死［4］；来自p53核心区的结构肽，可以稳定p53的结构和恢复变异p53诱导肿瘤细胞凋亡的功能. p53羧基端肽任意的盘绕结构能够穿过细胞膜，捆绑在细胞内的靶目标上，引起细胞凋亡，它是选择性地诱导细胞死亡，对正常细胞或非肿瘤细胞没有毒性，并且对p53变异型的肿瘤细胞作用更强，尤其是当p53羧基端肽和膜渗透肽嵌合后可以有效增强抗肿瘤作用［5］. p53羧基端肽的抗肿瘤作用是p53依赖性的，它是通过FADD/caspase8途径特异的导介肿瘤细胞的凋亡［6-8］，故通过转导p53羧基端肽挽救p53的功能是一种新的方法. 然而只利用生物短肽肿瘤，由于肽容易被降解需要反复多次注射，在体内的半衰期较短，水溶性、稳定性差，生物利用度低，对在体肿瘤不能达到有效浓度剂量.
 
　　细胞穿膜肽可有效将多肽、蛋白质分子及DNA片段，通过无受体介导、无耗能的方式，导入多种哺乳动物细胞，并且细胞膜亲和性高，穿膜速度快，且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤［9］. 穿膜肽可有效将目的基因片段导入细胞内［10］，有望解决目前运用病毒载体进行基因治疗时，转染效率低的主要问题，具有较高的临床治疗价值，已应用于肿瘤细胞系、动物移植瘤的治疗，为此我们在表达盒中设计了Ant穿膜肽［11］. 基因转移载体的设计是基因治疗研究中的一个关键，理想的体内基因转移载体应用有较好的细胞靶向性、目的基因表达的可控性以及转移方法的简单易行，以往在基因治疗的研究中，逆转录病毒，腺病毒等载体应用较多. 随着研究的深入，人们发现上述载体由于自身的某些缺陷不能满足研究与治疗的需要. AAV载体则避免了上述载体的缺陷，是近年来使用的转导效率高的病毒载体，提高了转导效率，并能感染分裂和非分裂细胞，适合肿瘤基因治疗［12］. 为此本课题成功地将回收的嵌合NT4p53(C22)Ant cDNA片段亚克隆于腺伴随病毒穿梭质粒pSSHGCMV中，构建了重组质粒pSSHGCMVNT4p53(C22)Ant. 应用斑点杂交试验检测重组病毒AAVNT4p53(C22)Ant的滴度为2×1010/mL. 为了提高腺伴病毒载体的转导效率，我们用了神经营养因子(NT4)信号肽，引导肽与目的短肽相连接.
 
　　我们发现，AAVNT4p53(C22)可导致肿瘤形态变异，数目减少，证明了AAVNT4p53(C22)Ant重组腺伴病毒对胰腺癌细胞系MiapacaⅡ的杀伤作用；PI流式细胞检测发现治疗组细胞凋亡较对照组增多；LDH检测结果显示随着AAVNT4p53(C22)对MiapacaⅡ转染时间的增加，培养基中LDH逐渐增加，但与空病毒组与未处理组间无差异. LDH测定是检测细胞坏死情况的指标，表明重组病毒对细胞的杀伤作用不是引起细胞坏死，而是细胞的凋亡，这同流式细胞仪检测的结果一致. 再次证实了AAVNT4p53(C22)Ant对胰腺癌细胞MiapacaⅡ有杀伤作用，并且是通过引起细胞凋亡而实现的.

　　【】

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