胃癌组织中runx3 mRNA和蛋白的表达及其临床意义

         作者：李华，李勇，范立侨，王力利，赵群，赵雪峰，焦志凯

【关键词】  ,胃肿瘤；runx3基因；印迹法,蛋白质；逆转录聚合酶链反应

　　Expression of runx3 mRNA and protein in gastric carcinoma and its correlation with clinicopathological parameters

　　【Abstract】  AIM: To investigate the expression of runx3 gene mRNA and protein in human gastric carcinoma and surrounding normal tissue and  its correlation with clinicopathological parameters. METHODS:  RNA and protein were extracted from 60 human gastric carcinoma and surrounding normal tissue specimens. Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) and Western blot were used to detect the runx3 mRNA and protein level. RESULTS:  The relative expression value of runx3 mRNA found in human gastric carcinoma specimens was 0.7542±0.1284, and that did in surrounding normal tissue specimens was 0.8427±0.0541（t=4.941, P<0.0001）. The integral optical density value of runx3 protein confirmed in human gastric carcinoma specimens was 10828±989.9 and that did in surrounding normal tissue specimens was 47833±7566 ( t=35.57, P<0.0001）. RTPCR and Western blot indicated expression of runx3 in gastric carcinoma was significantly lower than that in  corresponding normal stomach tissue respectively. CONCLUSION:  Lower expression of runx3 gene mRNA and its protein in the gasric carcinoma probably plays an important role in the tumorigenesis and development of gastric carcinoma.

　　【Keywords】  stomach neoplasms; runx3 gene; blotting, western; reverse transcriptase polymerase chain reactior

　　【摘要】  目的： 探讨runx3基因mRNA及其蛋白在胃癌与正常胃粘膜组织中的表达差异及其临床病理相关因素之间的关系. 方法: 采用逆转录多聚合酶链反应（RTPCR）和Western Blot技术对临床60例胃癌新鲜标本及其周围正常粘膜组织中runx3基因和蛋白的表达进行检测，并对其表达和各临床病理参数的关系进行分析. 结果： RTPCR结果显示runx3mRNA在胃癌组织标本中的表达量相对值(0.7542±0.1284)低于正常胃癌粘膜组织中的表达量(0.8427±0.0541)，两组比较差异有统计学意义（t=4.941， P<0.0001）；Western Blot结果显示runx3蛋白在胃癌组织标本中的积分光密度值(10828±988.9)明显低于在正常胃粘膜组织中的光密度值(47833±7566)，两组比较差异有统计学意义（t=35.57， P<0.0001）. 结论：  runx3 mRNA及其蛋白在胃癌组织中的表达量明显低于正常组织. runx3基因的表达异常在胃癌的发生过程中起着重要作用.

　　【关键词】  胃肿瘤；runx3基因；印迹法，蛋白质；逆转录聚合酶链反应

　　0引言

　　人类runt相关转录因子3（human runtrelated transcription factor 3, runx3）是runt家族中新近受到广泛关注的基因，它是哺乳动物RUNT家族进化的基础［1］，定位于人染色体1号短臂1p36上. 转化生长因子（transforming growth factor beta, TGFβ）是许多细胞的有效抑制因子其信号紊乱将导致许多肿瘤的发生. 近年来研究发现，runx蛋白可指导TGFβ信号转到过程中激活的Smad复合物从细胞质内转入细胞核内特定靶位点，加强Smad复合物与靶位点的结合强度并激活靶基因, 从而对细胞的分化、细胞周期调控、凋亡和恶性转化起作用［2］. 在众多的肿瘤中均发现了染色体1p36的异常［3-5］，因此作为一种新的候选肿瘤抑制基因，runx3受到广泛关注. 为进一步明确runx3基因在胃癌发生、发展中的作用，本研究检测60例胃癌新鲜组织和正常胃粘膜组织中的runx3基因和其蛋白的表达，探讨runx3基因表达及其临床意义.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1标本 60例胃癌和其对应的正常胃粘膜组织取自我院自20051/200508的手术切除标本，并立即放于液氮中速冻，-80℃冻存备用. 年龄28~80（平均57）岁,男34例,女26例,有淋巴结转移的33例. 所有标本术后均经病理证实.
 
　　1.1.2试剂Trizol 购自Invitrogen公司. cDNA第一链反应试剂盒购自Fermentas公司. PCR引物序列由上海生工生物工程公司合成. 考马斯亮蓝蛋白分析试剂盒购自南京建成生物公司. runx3兔单克隆抗体购自Abcom公司，Actin小鼠单克隆抗体购自Lab Vision公司. 辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗购自Sigma公司.
 
　　1.2方法

　　1.2.1组织总RNA和组织蛋白提取将组织标本研磨后，采用Trizol细胞裂解法按照说明书提取组织样本总RNA和组织蛋白，备用.
 
　　1.2.2逆转录多聚合酶链反应（RTPCR）紫外分光光度计定量总RNA,调整浓度为:1 g/L. 按cDNA第一链反应试剂盒说明书采用随机引物法合成cDNA. 用GAPDH做为内参照进行PCR. runx3的引物序列：上游： 5′GATGGCAGGCAATGACGA3′，下游：5′TGCTGAAGTGGCTTGTGGT3′,扩增长度：353 bp. GAPDH的引物序列：上游：5′AACGGATTTGGTCGTATTG3′, 下游：5′GGAAGATGGTGATGGGATT3′，扩增长度： 208 bp. PCR 参数: 94℃ 5 min 变性;94℃ 45 s, 55℃ 55 s,  71℃ 45 s,32个循环;72℃延伸7 min. PCR产物于20 g/L琼脂糖电泳，电压60 V， 55 min. Gel ID 凝胶图像分析系统摄片并测定分析其光密度. 各个样本runx3表达水平，表达量的相对值（relative expression value）=待测基因扩增条带的灰度值/GAPDH基因扩增条带的A值.
 
　　1.2.3Western Blot检测runx3蛋白在肿瘤组织和正常组织中表达的差异将组织总蛋白用考马斯亮蓝试剂盒定量. SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白后，100 V转膜120 min. 凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，按照100 μL/cm2 加入1∶80用1×TBS稀释的一抗，4℃过夜. 1×TBS漂洗硝酸纤维素膜5 min×3. 按照100 μL/cm2加入1∶800用1×TBS稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃ 1 h. 用1×TBS漂洗膜5 min×3次. 最后用DAB显色8~10 min，至膜上出现红棕色条带，显色适度时蒸馏水漂洗中止显色反应，拍摄滤膜照片. 并用Gel ID 凝胶图像分析系统测A值. 分析计算各个样本runx3蛋白的A值.
 
　　统计学处理：  数据用x±s表示,采用SPSS10.0统计软件对胃癌和正常粘膜组织间的runx3表达量及光密度行配对t检验，对临床病理因素间runx3的表达行成组t检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1runx3 mRNA在胃癌和正常粘膜组织中的表达正常粘膜组织中扩增产物电泳条带比胃癌组织中较清晰，扩增片段大小与所设计的大小完全一致，分别为353 bp和208 bp. runx3表达量相对值在胃癌组织和正常粘膜组织中分别是(0.7542±0.1284)和(0.8427±0.0541, 图1)，两者差异有统计学意义（t=4.941， P<0.0001）.

　　M：Marker; N：正常组织;T：肿瘤.

　　图1RTPCR分析runx3mRNA在胃癌组织和正常粘膜内的表达（略）

　　2.2runx3蛋白在胃癌和正常粘膜组织中的表达runx3 A值在胃癌组织和正常粘膜组织中分别为(10828±989)和(47833±7566)（图2），两组相比有统计学意义 （t=35.57，P<0.0001）.

　　N：正常胃粘膜组织;T：肿瘤组织.

　　图2Western Blot分析runx3蛋白在胃癌组织和正常粘膜内的表达（略）

　　2.3runx3的表达与胃癌临床病理因素的关系runx3 mRNA的表达与胃癌的分化程度及淋巴结转移有关(P<0.01), 而与性别、肿瘤大小无关(P>0.05，表1）.

　　3讨论

　　Runt家族包括3个基因其家族成员均具有含123个氨基酸Runt Domain (RD区域)，runx蛋白与Smad2, Smad3形成复合物传递TGFβ/activin信号，都与人类疾病的发生密切相关. runx3含有2个高度保守的CpG岛，其中一个大的CpG岛位于runx3基因启动子P2周围，其内富含有GC启动子的特征控制runx3基因的转录［1］. 目前研究发现消化道肿瘤如胃癌、胆管癌、胰腺癌和肝细胞癌中均有染色体1p36异常［6-7］. runx3基因则作为一种肿瘤抑制基因,与多种肿瘤的发生发展相关.

　　表1runx3 mRNA表达与其临床病理因素的关系（略）

　　在45%~60%的胃癌细胞系和胃癌组织中，有紧邻P2启动区的CpG岛的甲基化［8-9］. 研究发现在30%的胃癌中有1p36.1的杂合性缺失，而runx3的点突变则为0.8%［10］. 本研究结果表明胃癌中runx3的表达量明显低于正常粘膜组织，由此可见,在胃癌发生、过程中runx3基因表达在低分化和伴有淋巴结转移组中明显低于中高分化和未转移组. 因此，近年来部分学者更倾向于runx3基因是一种抑癌基因，在胃癌发生中起重要作用.
 
　　runx3蛋白作为TGFβ信号通路下游的一个转录因子其内部的RD区域β亚单位可与蛋白结合,阻止了runt区域的泛素化且稳定runx蛋白，增加其与DNA的亲和力. 本研究结果发现胃癌组织中runx3蛋白的表达低于正常粘膜组织，说明在胃癌的发生发展过程中可能由于runx3基因的失活导致了其编码的蛋白不能够表达，影响了其功能的发挥从而导致胃癌的发生.
 
　　runx3在胃癌中存在异常表达，在胃癌的发生、发展中起一定作用，runx3基因作为胃癌的一种新的抑癌基因，对其参与胃癌发生、发展的具体机制的进一步研究必将对胃癌的临床早期诊断和带来新的启示.

　　【】

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