人DNA修复基因HOGG1真核表达载体的构建及序列测定
作者：魏永长，南克俊，惠凌云，贺大林
【关键词】 遗传载体；HOGG1基因；克隆,分子；DNA修复
Construction and sequencing of eukaryotic expression vector of human DNA base excision repair gene HOGG1
【Abstract】 AIM: To clone human DNA base excision repair gene, 8oxoguanineDNA glycosylase (HOGG1), and construct its eukaryotic expression vector with sequence analysis. METHODS: Total RNA was extracted from the liver tissue of human foetus by the guanidinium thiocyanate method. The whole HOGG1 coding gene was amplified by RTPCR and cloned into eukaryotic expression vector pCMVMyc. Plasmid DNA was extracted and subjected to restriction enzyme analysis. Clones representing cDNA inserts were sequenced. RESULTS: The construction of eukaryotic expression vector pCMVMyc/ HOGG1 was successful and the resulted sequence completely coincided with the designs. CONCLUSION: The construction of eukaryotic expression vector pCMVMyc/ HOGG1 provides a new way for biological targeted therapy involving DNA base excision repair gene HOGG1.
【Key words】 genetic vectors; HOGG1; cloning, moleculor; DNA repair
【摘要】目的： 克隆人HOGG1基因并构建其真核表达载体，进行序列测定. 方法： 提取人胎肝总RNA，设计HOGG1特异性引物，通过RTPCR扩增，将HOGG1基因克隆到pCMVMyc载体,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序验证. 结果： 获得人HOGG1基因全长，并成功构建pCMVMyc/HOGG1真核表达载体. 结论： HOGG1真核表达载体的构建为HOGG1基因生物靶向药物的开发提供一种新的手段.
【关键词】 遗传载体；HOGG1基因；克隆，分子；DNA修复
0引言
细胞的有氧代谢过程及其暴露于环境诱变剂时均可产生活性氧(reactive oxygen species, ROS) ［1-2］. 在患病情况下,生物的抗氧化能力有一定限度, 一旦生物体内的氧化应激负荷超过抗氧化系统所承载的极限, ROS便可攻击DNA造成DNA损伤. 损伤的DNA在再次复制和分裂时可形成突变. DNA突变可激活癌基因或使抑癌基因失活,从而导致细胞生长周期紊乱. DNA氧化损伤产生大量的修饰碱基, 其中8羟基鸟嘌呤（8oxoG）能高度致突变性损伤. 鉴于此，研究者把它用作肿瘤发生过程中氧化损伤的敏感标志物［3］. HOGG1基因编码的hOgg1 蛋白具有DNA 修复功能, 参与8oxoG的切除,从而保护遗传物质不受损伤［4］. 我们采用基因工程的方法, 从人胎肝组织中克隆人HOGG1基因，并构建其真核表达载体，以进一步研究该基因在肿瘤DNA 氧化损伤修复中的作用.
1材料和方法
1.1材料Trizol(invitrogen公司)；限制性内切酶EcoRI/KpnI(SibEnzyme公司)；pCMVMyc载体试剂盒(Clonetech公司)； RNA酶抑制剂和 MMLV逆转录酶（Promega公司）；Taq酶、DH5α感受态细菌、凝胶回收试验盒、所有寡核苷酸和引物及克隆测序均由上海申能博彩公司提供. 其他试剂为通用高纯试剂. DNA扩增采用PE9600扩增仪.
1.2方法
1.2.1RTPCR扩增HOGG1基因取来自于意外流产的100 mg人胎肝组织,在液氮中研磨至粉末状，加入1 mL Trizol，按产品提供的操作手册抽提总RNA. 紫外吸收测定法检测RNA浓度和纯度，使A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.1之间. 变性琼脂糖凝胶电泳, 紫外透射光下观察并拍照. 在2 mg总RNA中，加入DEPCH2O，使总体积为8 mL，加入0.5 mL RNA酶抑制剂、 2 mL oligo(dT) 引物、400 U MMLV RT逆转录合成cDNA第一链，逆转录反应为37℃ 1 h，90℃ 5 min，冰上冷却，室温高速离心5 s. 将cDNA溶液储存于-20℃备用. GenBank登录的HOGG1基因的cDNA序列 (NM_016820.2)设计扩增HOGG1全长的引物. 上游引物序列为F(Eco RI)：5′AGAGAATTCGGATGCCTGCCCGCGCGCTTCTG3′，上游引物从起始密码子ATG开始. R(KpnI)下游引物序列为：5′TTTCTGGTACCGATAAAACCATCCTTAGCG 3′，终止于终止密码子TGA，即该序列中的TCA. 分别在上游引物5′，下游引物3′端引入EcoRI和KpnI的酶切位点，目的是为了克隆到真核表达载体pCMVMyc对应的位点中. 预期扩增产物长度为1233 bp. PCR反应体系50 μL： 25 mmol/L的PCR特异引物各1 μL ，Taq聚合酶0.5 μL， dNTP混合液0.5 μL，cDNA 2 μL. 扩增条件： 94℃变性5 min,94℃ 30 s, 55℃ 40 s，72℃ 40 s，35个循环后，72 ℃延伸10 min. PCR扩增产物用12 g/L琼脂糖电泳，胶回收试剂盒回收目的条带.
1.2.2HOGG1基因真核表达载体的构建及鉴定PCR扩增产物用EcoRI和KpnI双酶切2 h，凝胶回收试剂盒回收DNA，该片段与同样双酶切回收后的pCMVMyc载体连接，转化宿主E.coli DH5a感受态细胞（氯化钙法），挑取单克隆白色菌落筛选重组质粒. 重组克隆用克隆PCR方法鉴定，鉴定引物为载体测序引物CMVF和扩增HOGG1的下游引物，扩增条件同上,扩增产物大小正确的克隆，用含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB培养，用质粒制备试剂盒制备质粒，阳性用于序列测定.
2结果
2.2.1HOGG1基因扩增成功地扩增出全长的HOGG1基因. 图1为RTPCR的扩增产物，电泳可见1200 bp左右的扩增条带，与预计的大小基本吻合.
2.2.2构建HOGG1基因真核表达载体通过RTPCR扩增HOGG1获得PCR产物，经过胶回收酶切产物，回收直接克隆到pCMVmyc载体对应的位点，转化大肠杆菌. 通过菌落PCR方法，初步筛选出重组克隆（图2）. 随机挑选出5个克隆，其中一克隆（泳道1），与其他4个克隆（泳道25）相比,插入片段偏小,没有做进一步分析. 泳道2～5共4个克隆插入大小一致，经过测序分析，结果表明这4个克隆的插入片段为HOGG1基因. 通过序列分析和比较部分克隆的序列与预计的不同，泳道5对应的序列与Genbank公布的序列相同.
2.2.3序列测定05TH1CMVF测序报告表明，在该报告中显示pCMVMYC载体的部分序列，酶切位点EcoRI GAATTC, 启动密码子ATG和HOGG1 基因N端的部分序列. 采用ABI377 序列分析仪分析插入片段的序列,阳性克隆进一步测序结果表明，05TH1CMVF；51TH1G6509；52TH1CMVR 拼接为HOGG1全序列（图3）.
M： marker； HOGG1： HOGG1基因.
图1RTPCR扩增hOGG1基因产物 （略）
1～5：pCMVMyc/ HOGG1重组克隆；M：marker.
图2重组质粒EcoRI/KpnI双酶切鉴定（略）
图305TH1CMVF；51TH1G6509；52TH1CMVR测序报告（略）
3讨论
通过对DNA修复机制的多年研究，Fortini等［5］报道同时修复8oxoG涉及12种已知蛋白（hOgg1, APE1, hMYH, hMSH2, hMLH1, hMTH1, DNA 聚合酶β, DNA 聚合酶δ/ε, FEN1, PCNA ,DNA 连接酶 I ,DNA 连接酶 III/XRCC1）. 已明确OGG1(8氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶)是修复氧自由基造成DNA损伤的第一环节［4］. HOGG1 基因位于人染色体3p2526区域内,整个基因由7 个外显子和6 个内含子组成, 起始子ATG 和终止子TAG序列分别位于第1 和第7 外显子中. HOGG1 基因选择性拼接产生至少两种mRNA,分别编码345和424个氨基酸,分子质量各自为39 Ku 和47 Ku. 在DNA 氧化损伤的过程中,HOGG1 基因编码的hOgg1蛋白具有DNA 修复功能,而且其作用具有底物特异性,即8oxoG特异的DNA 结合活性. hOgg1 蛋白的DNA 糖苷酶活性可以切除内源性和环境因素引起的异常碱基8oxoG. 此外,hOgg1 蛋白还具有AP 裂解酶活性,可在糖基化产生的AP 位点处将DNA 链切除,以修复自发碱基丢失或因DNA 糖苷酶作用后产生的、可阻断DNA 复制的脱嘌呤或脱嘧啶(AP) 位点［6］.
HOGG1基因在维护基因组稳定和预防癌症发生上具有重要的作用,目前,国外已从各个方面蓬勃开展对于HOGG1基因的研究，而国内报道主要集中于基因的结构及多态性方面［7-9］. pCMVMyc是运用非常广泛的真核表达载体，内含标签MYC,外源基因与MYC融合表达，通过检测MYC的表达，可以间接获得外源基因的表达量［10］. 我们GenBank登录的HOGG1基因的蛋白序列设计引物，采用RTPCR技术从人胎肝组织中成功扩增出HOGG1全长基因，并通过设计引物时在上游与下游引物3′，5′端分别加入不同的酶切位点EcoRI和KpnI，确保目的片段单方向插入，定向克隆入pCMVMyc真核表达载体. 序列测定结果显示所得HOGG1基因片段序列与GenBank所载全长序列完全相同，且插入方向正确，重组子双酶切鉴定释放出预定长度片段，表明我们已获得全长靶基因，为DNA修复基因HOGG1的临床应用打下了良好基础，而成功构建的真核表达载体pCMVMyc/HOGG1则为生物靶向药物如逆转DNA氧化损伤的微囊化基因工程细胞及疫苗等的开发提供一种新的手段.
【参考】
［1］ 单伟颖,王兴艳,单伟超,等. 急性敌百虫中毒导致女性体内的氧化应激和自由基损伤［J］. 第四军医大学学报, 2004,(14):74-76.
［2］ 徐文,海春旭,杨晨, 等. CLA对2型糖尿病大鼠肝脏线粒体呼吸链酶活性及氧化应激的影响［J］. 第四军医大学学报,2005,(23):32-35.
［3］ Nakabeppu Y, Sakumi K, Sakamoto K, et al. Mutagenesis and carcinogenesis caused by the oxidation of nucleic acids［J］. Biol Chem, 2006,387(4):373-379.
［4］ Conlon KA, Zharkov DO, Berrios M. Immunofluorescent localization of the murine 8oxoguanine DNA glycosylase (mOGG1) in cells growing under normal and nutrient deprivation conditions［J］. DNA Repair (Amst), 2003,2(12):1337-1352.
［5］ Fortini P, Pascucci B, Parlanti E, et al. 8Oxoguanine DNA damage: at the crossroad of alternative repair pathways［J］. Mutat Res, 2003,531(12):127-139.
［6］ Nishimura S. Involvement of mammalian OGG1(MMH) in excision of the 8hydroxyguanine residue in DNA［J］. Free Radic Biol Med, 2002,32(9):813-821.
［7］ 张遵真，张勤，吴媚. HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及初步的功能研究 ［J］. 四川大学学报（医学版）,2006,37(2):165-170.
［8］ Luna L, Rolseth V, Hildrestrand GA, et al. Dynamic relocalization of hOGG1 during the cell cycle is disrupted in cells harbouring the hOGG1Cys326 polymorphic variant［J］. Nucleic Acids Res, 2005,33(6):1813-1824.
［9］ Mistry P, Herbert KE. Modulation of hOGG1 DNA repair enzyme in human cultured cells in response to prooxidant and antioxidant challenge［J］. Free Radic Biol Med, 2003,35(4):397-405.
［10］ Jin Y, McEwen ML, Ghandour MS, et al. Overexpression of XIAP inhibits apoptotic cell death in an oligodendroglial cell line［J］. Cell Mol Neurobiol, 2004 ,24(6):853-863.
