组胺对肺上皮细胞Toll样受体表达的上调作用
【关键词】 组胺；肺/细胞学；上皮细胞；Toll样受体
【Abstract】 AIM: To investigate the upregulatory effect of histamine on Tolllike receptor (TLR) expression in pulmonary epithelia cells. METHODS: TLR1TLR10 mRNA expressions were determined by RTPCR in resting A549 cells, and by realtime quantitive PCR in the cells following stimulation with histamine at various concentrations and at various periods of time. Furthermore, the upregulatory effect of histamine on TLR3 was examined by flow cytometry. RESULTS: TLR1TLR10 mRNA were constitutively expressed in A549 cells. Histamine significantly enhanced TLR3 expression at both mRNA and protein levels in a concentration and timedependent manner. This effect of histamine was blocked by the H1 receptor antagonist. CONCLUSION: TLR3 expression can be upregulated by histamine in A549 cells, which suggests that excessive histamine can enhance the sensitivity of pulmonary epithelium to virus infection when the allergic diseases exist in the respiratory tract.
【Keywords】 histamine, lung/cytology; epithelial cells, Tolllike receptor
【摘要】 目的： 观察组胺对肺上皮细胞中Toll样受体（TLR）表达的影响. 方法： 体外培养人肺上皮细胞株A549，用RTPCR和实时定量PCR检测静息状态或组胺作用下的A549细胞中TLR1～TLR10 mRNA的变化，并用流式细胞术进一步确定组胺对TLR3表达的调节作用. 结果： A549细胞有TLR1～TLR10 mRNA的组成型表达，组胺对TLR3 mRNA和蛋白的上调作用具有时间和剂量依赖性，并且H1受体阻断剂可抑制组胺对TLR3的上调作用. 结论： 组胺可上调肺上皮细胞中TLR3的表达，提示当呼吸道存在变态反应性病变时，增多的组胺可能会增加肺上皮细胞对病毒感染的敏感性.
【关键词】 组胺；肺/细胞学；上皮细胞；Toll样受体
呼吸道病毒感染是支气管哮喘急性发作的一个重要诱因［1］，而有关哮喘急性发作时呼吸道对病原菌感染的敏感性及其机制目前尚不清楚. Toll样受体（Toll likereceptor, TLR）是一类在天然免疫识别中具有重要作用的模式识别受体，目前在人体内至少已发现TLR家族中的10个成员(TLR1～TLR10). TLR广泛表达于各类组织细胞中，且许多炎性介质可影响TLR的表达［2］. 组胺是一种在支气管哮喘中发挥重要作用的介质，有研究显示：组胺可上调血管内皮细胞中TLR2和TLR4的表达［3］. 本研究旨在通过观察组胺对肺上皮细胞中TLR表达的影响，探讨哮喘急性发作与呼吸道感染之间的关系.
1材料和方法
1.1材料人肺上皮细胞株A549购自美国ATCC(American Type Culture Collection)，胎牛血清、DMEM培养基购自Hyclone公司. TRIzol RNA提取试剂、ProofStart DNA聚合酶和Quanti Tet TM SYBR Green PCR Kit购自Invitrogen公司,RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶均购自Promega公司. 人TLR1～TLR10及βactin的PCR引物由上海生工生物工程公司合成. PCR产物回收试剂盒购自上海生工生物工程公司. FITC小鼠抗人TLR3 mAb（IgG1，40C1285）购自Imgenex公司， FITC小鼠IgG1同型抗体购自Chemican International公司. 组胺、盐酸苯海拉明购自Sigma公司.
1.2方法
1.2.1细胞培养A549细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基,于37℃, 50 mL/L CO2的培养箱中培养, 每2～3 d 传代1次,所有试验均使用对数期细胞.
1.2.2RTPCR检测A549细胞在静息状态下TLR1～TLR10 mRNA的表达当在25 cm2培养瓶中的A549细胞达到80%～90%以上的融合状态时,改用不含血清的DMEM继续培养12 h. 在去除培养瓶中的DMEM后，按Trizol试剂盒说明书的步骤提取总RNA. 按MMLV产品说明书推荐的方法合成cDNA第一条链. PCR反应体系为： 取cDNA 3 μL, 25 mmol/L MgCl2 4 μL, 10 mmol/L dNTP 1 μL, 10×缓冲液 5 μL, Taq DNA Polymerase 2.5 U, 5 μmol/L的上游引物和下游引物各5 μL，用去离子水将总体积补至50 μL. TLR1～TLR10和βactin的引物序列见表1. PCR反应条件为：95℃ 变性15 s,58℃退火15 s, 72℃延伸30 s，共40个循环，最后72℃，10 min结束反应. 将10 μL PCR产物与1 μL SYBR Green I Stain (Cambrex, San Diego, CA) 染料混匀后，在15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，最后用凝胶成像系统记录、保存结果.表1RTPCR和实时定量RTPCR中的引物序列及扩增片段长度
1.2.3实时定量PCR检测组胺对A549细胞中TLR1～TLR10 mRNA表达的调节作用当在25 cm2培养瓶中的A549细胞达到80%～90%以上的融合状态时,改用不含血清的DMEM. 在加入不同剂量组胺（0, 1, 10, 100 μmol/L）和苯海拉明（10 μmol/L），刺激一定时间（0,2,12, 24 h）后，提取细胞总RNA并合成cDNA第一条链（方法及所用TLR1～TLR10引物序列同1.2.2）. PCR反应体系为： cDNA 1.5 μL, 5 μmol/L的上、下游引物各5 μL, Quanti Tet TM SYBR Green PCR Kit提供的2×Quanti Tet TM SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，用去离子水将总体积补至25 μL. 在ABI PRISM 7700(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)定量PCR仪上按以下条件扩增： 95℃ 15 s, 58℃ 15 s, 72℃ 30 s共40个循环，同时记录溶解曲线. 上述各组试验均重复5次.
1.2.4建立标准曲线在普通PCR上扩增TLR1～TLR10 和βactin，将回收产物作为标准品. 在紫外分光光度仪上测定产物的A260 nm和A280 nm后，根据阿佛加德罗常数出标准品的拷贝数. 将标准品稀释成1×109～1×1014拷贝/L后，行荧光定量PCR，根据每个标准品达到域值时的循环数（Ct值）绘制出标准曲线. 由标准曲线和样品的Ct值计算出样本的初始拷贝数.
1.2.5流式细胞术检测A549细胞中TLR3蛋白的表达当在25 cm2培养瓶中的A549细胞达到80%～90%以上的融合状态时,改用不含血清的DMEM培养. 加入100 μmol/L组胺或苯海拉明（10 μmol/L）刺激细胞2, 12, 24 h后，细胞用2.5 g/L胰酶消化成单细胞悬液，600 g, 4℃，离心5 min. PBS洗涤2次后，用含1 mL/L TritonX100的20 g/L多聚甲醛1 mL重悬细胞，并在冰上固定30 min. PBS再次洗涤2次后，在50 μL总体积中分别加入FITC小鼠抗人TLR3 mAb 6 μL，对照组加入FITC小鼠IgG1同型抗体10 μL，4℃温育1 h. 标记好的细胞经PBS洗涤2次，并用10 g/L多聚甲醛固定后在流式细胞仪（Becton Dikinson公司，美国）上检测细胞的荧光密度值.
统计学处理： 实验数据以x±s表示, 经SPSS10.0统计软件处理，方差齐时用t检验(Independent Samples Test)，方差不齐时用秩和检验(KruskalWallis Test).
2结果
2.1TLR1～TLR10 mRNA在A549细胞中的组成型表达在A549细胞未受任何刺激的情况下，以细胞的mRNA为模板，RTPCR 扩增cDNA片段，经20 g/L琼脂糖凝胶电泳显示： 2至11泳道均有核酸条带，且条带的大小与TLR1～TLR10引物设计的理论值一致（图1）. 说明人肺上皮细胞有TLR1～TLR10 mRNA的组成型表达.
2.2组胺对A549细胞中TLR1～TLR10 mRNA表达的调节作用用100 μmol/L组胺刺激A549细胞2 h后，检测TLR1～TLR10和βactin的mRNA表达. TLR3 mRNA的表达较未予刺激的对照组明显增高(P＝0.008,图2)，而其他TLR 的mRNA变化与对照组比较无统计学意义(P>0.05).
2.3苯海拉明对组胺上调A549细胞中TLR3 mRNA表达的抑制作用用10 μmol/L苯海拉明与细胞先孵育1 h后，再加入100 μmol/L组胺刺激，则TLR3 mRNA的表达为16±7，明显低于只加组胺组(P=0.009)；而只用10 μmol/L苯海拉明时，TLR3 mRNA的表达（14±6）与对照组相比无明显变化（P＝0.095）.
2.4不同剂量组胺对A549细胞中TLR3 mRNA的上调作用分别用0, 1, 10, 100 μmol/L组胺刺激A549细胞2 h后，TLR3 mRNA的表达（每1×104个βactin拷贝所对应的TLR的拷贝数,n=5）分别为9±4, 59±34, 97±54和116±65. 1, 10, 100 μmol/L的组胺均能明显上调TLR3 mRNA的表达（与未予刺激的对照组相比，其P值为0.008）. 尽管1 μmol/L组和100 μmol/L组之间的TLR3 mRNA表达无显著性差异（P＝0.151），但随着组胺浓度的增加，TLR3 mRNA的表达也明显增加.
2.5A549细胞中TLR3在组胺刺激后不同时相点的变化用100 μmol/L组胺刺激细胞2, 12, 24 h后，TLR3 mRNA的表达（每1×104个βactin拷贝所对应的TLR3的拷贝数，n=5）分别为116±65, 123±72和50±28，均明显高于未予刺激的对照组（9±4, P=0.008）,但各刺激组之间的TLR3 mRNA表达无明显差异(P＝0.95). 用流式细胞术检测A549细胞中TLR3蛋白的表达时也发现： 100 μmol/L组胺能明显上调TLR3蛋白的表达，且苯海拉明能阻断组胺对TLR3蛋白的上调. 组胺刺激2 h后TLR3蛋白有所增高；12后组胺对TLR3蛋白的上调作用达到最高；24 h后TLR3蛋白的表达明显减弱（图3）.
3讨论
肺脏是各种病原微生物最常累及和最先攻击的重要靶器官. 肺上皮不仅是抵御病原菌的一道物理屏障，而且肺上皮细胞还能通过TLR识别病原菌，生成大量细胞因子和炎性介质，从而对局部的炎症反应产生影响［4］. 呼吸道病毒感染是哮喘加重的重要诱因，但有关哮喘如何影响呼吸道感染的问题，目前尚不十分清楚. 最近有［3］报道，在支气管哮喘中发挥重要作用的组胺能上调内皮细胞中TLR2和TLR4的表达，并增强内皮细胞对革兰阴性菌和革兰阳性菌的敏感性. 而有关组胺对肺上皮细胞中TLR的调节作用，尚未见有报道.
尽管人们已经观察到肺上皮细胞中有TLR mRAN的表达，但有关TLR1～TLR10 mRNA的表达谱却不尽相同. 如Sha等［5］的研究显示，肺上皮细胞系BEAS2B细胞中有TLR1～TLR7和TLR9～TLR10 mRNA的表达；而Toshiki等［2］却在研究中观察到BEAS2B和A549细胞中主要是TLR2～TLR6 mRNA的表达. 我们的RTPCR结果显示： A549细胞中TLR1～TLR10均有的表达. 上述肺上皮细胞中TLR的不同表达结果可能与细胞的状态、所使用的试剂、引物等因素有关. 我们用组胺刺激A549细胞后，只观察到TLR3 mRNA表达的增高，而其它TLR的mRNA未见增高，并且H1受体阻断剂可抑制组胺对TLR3 mRNA的上调作用. 在进一步的研究中还发现组胺对A549细胞中TLR3 mRNA表达的上调作用还有一定的时间和剂量依赖性. 尽管本研究的流式细胞结果从蛋白水平上进一步确定了组胺对A549细胞中TLR3的上调作用，但在组胺刺激12 h后，TLR3蛋白的表达才达到最大，而组胺对TLR3基因的上调作用在刺激后2 h就基本达到了最高水平，这种TLR3蛋白上调较基因上调相对滞后的原因可能系TLR3蛋白的合成需要一定时间所致.
肺上皮细胞中的TLR3不仅可以识别双链RNA病毒，也可以识别侵入细胞的单链RNA病毒在复制时所形成的双链RNA，并激活下游信号通路和相关炎性细胞因子基因的表达［6］. 在支气管哮喘患者的气管壁和肺间质中，不仅肥大细胞细胞的数量明显增加，而且还伴有肥大细胞的脱颗粒和组胺的自发性释放，从而使局部的组胺浓度明显增高［7］. 另外，有研究显示：过敏性哮喘患者与非哮喘患者相比，更易发生下呼吸道的病毒感染，症状更重，而且病程也更长［8］. Grunberg等［9］也发现，病毒对哮喘患者呼吸道所造成的病理损伤明显重于对非哮喘患者所造成的损伤. 上述结果提示与哮喘病理状态有关的某种因素可能与病毒易感性及病变程度有关. 结合本实验中观察到的组胺对TLR3有明显的上调作用，我们推测，组胺对TLR3的上调作用可能是哮喘患者易患呼吸道病毒感染和病理损伤较重的一个重要机制.
【文献】
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