脂多糖对肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用

【关键词】  脂多糖类；肺表面活性剂；急性病,肺/损伤

    【Abstract】　AIM: To study the injuring effect of lipopolysaccharide(LPS) on alveolar type Ⅱ cells (ATⅡ) in acute lung injury (ALI). METHODS: Sixteen rats were evenly randomized into 2 groups: control group and LPS group. Control group were injected physiological saline through jugular vein; LPS group were injected LPS through jugular vein. Four hours later, the rats were sacrificed to collect the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Surface tension, total phospholipids(TPL), total protein(TP) and maleic dialdehyde(MDA) contents in the BALF were measured;  the activities of lactate dehydrogenase(LDH) and alkaline phosphatase(AKP) in BALF were detected. The pathological features of right lungs were observed under an  optical microscope. RESULTS: Compared with control group, LPS could increase the TP content ［(28±17)  vs (100±32) g/L, P<0.05］ and the activity of LDH ［(4.8±1.9) vs (8.4±1.9) μkat/L］in BALF (P<0.05), and the content of MDA in BALF(P<0.05); We could observe the interstitial pulmonary edema in LPS group by the microscopy; TPL could be decreased ［(432±45) vs (342±59) μg/kg］ and surface tension be increased ［(19.8±2.6) vs (23.3±2.9) mN/m］ by LPS(P<0.05); LPS could increase significantly the activity of AKP［(100±80) vs (360±100) nkat/L］ (P<0.05). CONCLUSION: LPS can injure the ATⅡand suppress the secretion of pulmonary surfactants in acute lung injury.

    【Keywords】　 lipopolysaccharides; pulmonary surfactants; acute lung/injuries

    【摘要】　目的： 研究急性肺损伤时脂多糖(LPS)对肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)的损伤作用. 方法： 将16只SD大鼠随机等分为生理盐水对照组、LPS模型组. 通过颈外静脉给药4 h后处死动物，收集肺泡灌洗液(BALF)，测定BALF表面张力、总磷脂含量(TPL)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)、丙二醛(MDA)及总蛋白(TP)含量；取右肺下叶，行HE染色光镜观察. 结果： 与对照组相比，LPS可提高BALF中LDH活性［（8.4±1.9） vs (4.8±1.9) μkat /L, P<0.05］ 和增加TP含量［(100±32）vs (28±17) g/L,  P<0.05］，使BALF中MDA含量升高；光镜下可见，LPS组呈典型间质性肺水肿表现；LPS可降低BALF中TPL含量［(342±59) vs (432±45) μg/kg, P<0.05］、增加表面张力［(23.3±2.9) vs (19.8±2.6) mN/m, P<0.05］，LPS组AKP活性较对照组显著升高［(360±100) vs (100±80) nkat/L, P<0.05］.  结论： LPS可以引起ATⅡ的损伤，并抑制其合成、分泌肺表面活性物质.

    【关键词】 脂多糖类；肺表面活性剂；急性病，肺/损伤

     急性肺损伤(ALI)由各种肺内外致病因素所致. 发病机制复杂、手段有限，尤其是在急性呼吸窘迫综合征阶段,死亡率高达50%以上. 肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ) 不仅可合成、分泌肺表面活性物质(PS)，还具有修复肺泡上皮、肺水转运、局部免疫等多种重要生理功能［1-3］，该细胞损伤是ALI发病过程中的重要环节之一. 脂多糖(LPS)是内毒素的主要生物活性成分，具有极强的生物活性,且肺是内毒素的主要靶器官之一. 现已明确革兰阴性菌感染、内毒素血症是ALI主要致病原因之一. 但是LPS是否对ATⅡ有损伤作用还存在较大争议，我们拟通过动物实验证实LPS对ATⅡ的损伤作用,进一步揭示ALI的发病机制.

    1材料和方法

    1.1材料成年SD大鼠16只，体质量200～250 g，雌雄各半（第四军医大学实验动物中心）；LPS（美国Sigma公司）；碱性磷酸酶(AKP)，乳酸脱氢酶(LDH)，丙二醛(MDA)试剂盒（南京建成生物工程研究所）；磷标准溶液由第四军医大学预防系营养与食品卫生学教研室高双斌高级实验师惠赠；725C型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）.1.2方法

    1.2.1动物分组将动物随机分为2组： ① 对照组(n=8)，经颈外静脉导管注入与LPS组等容积生理盐水; ② 模型组(n=8)，经颈外静脉导管注射2 mg/kg LPS，以复制ALI动物模型.

    1.2.2手术及标本采集将大鼠腹腔注射200 g/L乌拉坦5 mL/kg,麻醉后固定于鼠板;沿颈部正中切开皮肤,分离一侧颈外静脉,插入导管给药，给药后4 h行颈椎脱臼处死并行气管插管术，以20 mL/kg生理盐水进行支气管肺泡灌洗，连续3次，取第1次灌洗所得肺泡灌洗液(BALF) 0.2 mL用于表面张力的测量，收集所有BALF并记录BALF回收量，1000 r/min离心10 min，取上清，取其中1.4 mL用于测AKP, MDA, LDH,总蛋白(TP)等，剩余上清用于磷脂的提取.

    1.2.3肺组织的光镜观察取右肺下叶,以40 mL/L甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察.

    1.2.4BALF中AKP, MDA, LDH, TP的测量根据试剂盒说明书测量BALF中AKP, MDA, LDH的含量. 考马斯亮蓝G250染色法测定TP含量.

    1.2.5总磷脂(TPL)的测定采用Bartlett法［4］略有改进. BALF中加入2倍体积的氯仿-甲醇（2∶1, V/V）萃取液，震荡1 min, 2500 r/min离心10 min，弃上层液体但不弃界面杂质. 加入1/4体积的甲醇-水（1∶1, V/V）萃取液，震荡1 min, 2500 r/min离心10 min. 弃去上层液及界面杂质，氮气吹干，即得到TPL, -20℃保存待测. 将TPL加入1 mL高氯酸加热，温度由低到高逐渐上升，直至颜色由黑变白表示磷脂完全氧化为无机磷，继续加热蒸干高氯酸. 磷钼蓝比色法测定样本中无机磷含量. 根据磷脂中磷含量约为4%算出磷脂含量，再出每公斤体质量的磷脂含量.

    1.2.6表面张力的测定用毛细管法测定肺泡BALF表面相对张力,即将毛细玻璃管垂直插入到BALF中,测量毛细管内外液面高度差,然后根据拉普拉斯方程σ=rρg(h+r/3)/2出BALF的表面张力,以此来反映PS的含量及功能. 其中,σ为表面张力(单位为N/cm),r为毛细管的半径,ρ为液体密度,g为重力加速度,h为液体上升高度.

    统计学处理：　数据均以x±s表示, 组间差别以两样本t检验进行统计学处理，P<0.05认为有统计学差异.

    2结果

    2.1LPS对肺组织的损伤作用LPS可使BALF中TP含量、LDH活性升高，使BALF中MDA含量升高(表1). 光镜下可见LPS组大鼠肺间质较对照组明显增宽，有白细胞浸润，肺泡萎陷，肺不张，肺泡腔偶见红细胞，表现为间质性肺水肿（图1）.表1脂多糖对肺组织及肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用

    2.2LPS对ATⅡ的损伤作用LPS可使BALF中AKP活性升高近4倍，使BALF中TPL含量明显下降，表面张力明显升高(表1).

     3讨论

    革兰氏阴性菌感染、内毒素血症是引发ALI的常见原因. ATⅡ具有合成、分泌PS、增殖和修复、肺水转运及局部免疫等多种重要生理功能［1-3］，该细胞损伤是ALI发病过程中的重要环节之一［5-6］. ALI时LPS是否对ATⅡ有损伤作用还存在较大争议. 郑闵琴等［7］研究证明，LPS能使PS含量及活性下降，ATⅡ肿胀、变性、板层小体减少，肺组织面积密度增加. Romeron等［8］研究表明，LPS不仅对ATⅡ无损伤作用，还可以促进ATⅡ分泌PS. 本实验中，LPS可使BALF中TP含量升高，表明肺泡渗出增加； LDH是胞内酶，LPS组BALF中LDH活性增加表明细胞损伤加重；LPS组BALF中MDA含量升高，提示脂质过氧化作用增强. 上述3项指标变化符合急性肺损伤表现，表明LPS性急性肺损伤模型复制成功. AKP是ATⅡ的特异性分化标志，当ATⅡ损伤时被释放入BALF，LPS使BALF中AKP活性增强，表明其对ATⅡ有损伤作用；磷脂是PS的主要成分，TPL能反映PS含量变化，我们利用定磷法测量BALF中TPL含量,结果表明LPS可使BALF中TPL含量降低；表面张力反映了PS降低肺泡表面张力的功能，是ATⅡ合成、分泌PS的质和量的综合体现. 综合TPL及表面张力的变化，说表明LPS可以抑制PS的合成、分泌，其机制可能为内毒素血症时，肺血流阻力增加,肺组织缺血、缺氧，引起ATⅡ损伤，进而影响PS的合成、分泌，也可能是LPS对ATⅡ有直接损伤作用，进而使PS合成和分泌减少，具体作用机制尚有待于进一步研究.

    【】

    ［1］ Uhal BD. Cell cycle kinetics in the alveolar epithelium［J］. Am J Physiol, 1997,272(6Pt1):L1031-L1045.

    ［2］ Folkesson HG, Nitenberg G, Oliver BL, et al. Upregulation of alveolar epithelial fluid transport after subacute lung injury in rats from bleomycin［J］. Am J Physiol, 1998,275(3Pt 1):L478-L490.

    ［3］  Wright JR. Immunomodulatory functions of surfactant［J］. Hysiol Rev,1997,77(4):931-962.

    ［4］ Bartlett GR. Phosphorus assay in column chromatography［J］. Biol Chem, 1959,234(3):466-468.

    ［5］ Olson NC, KruseElliott KT, Johnson L. Effect of ly171883 on endotoxin  induced lung injury in pigs［J］. J Appl Physiol, 1990,69(4):1315-1322.

    ［6］ Hall SB, Venkitaraman AR, Whitsett JA, et al. Importance of hydrophobic apoproteins as constituents of clinical exogenous surfactants［J］. Am Rev Respir Dis, 1992,145(1):24-30.

    ［7］ 郑闵琴，汪盛贤，潘传敬，等. 内毒素损伤大鼠肺组织的面积密度变化及其发生机制［J］. 体视学与图像分析, 1999,4(4):251-256.

    ［8］ Romeron C, Benito E, Bosch MA. Effect of escherichia coli lipopolysaccharide on surfactant secretion in primary cultures of rat type Ⅱ pneumocytes［J］. Biochimica et Biophysica Acta, 1995,1256(3):305-309.