胸苷激酶系统血管靶向抗肝癌效应的机制

              作者：李宝金，张超，周玉梅，郝颖，刘晓平，区庆嘉

【关键词】  肝肿瘤；KDR启动子；基因;重组腺病毒；胸苷激酶系统；HepG2细胞；裸鼠,Balb/c

   【Abstract】 AIM: To explore the therapeutic efficacy and mechanism of HSVtk for targeting angiogenesis against hepatocellular carcinoma. METHODS: By using pAdeasy system, recombinant adenovirus containing kinase domain receptor (KDR) or cytomegalovirus (CMV) promotercontrolled HSVtk gene (AdKDRtk and AdCMVtk) was constructed. The virus was used to infect KDRexpressed human umbilical venous endothelial cells (HUVEC) and KDRunexpressed HepG2. Following administration of ganciclovir (GCV), the survival rate of genetransfected HUVEC and HepG2 was evaluated by using MTT method.  Hepatocarcinomas were transplanted in 32 Balb/c mice with HepG2 cells, which were subsequently divided into 4 groups: GCV group (Ⅰ), Ad group (II), AdCMVtk group (III) and AdKDRtk group (IV). Then selective administration of recombinant adenovirus or Ad intratumorally was performed in all rats. GCV was given at a dose of 100 mg/(kg・d) ip in the following days and for 10 d. Microvessel density (MVD) of tumor in all the treated animals was checked with the immunohistochemical methods and tumor burden was assessed 10 d before and after the last GCV administration. RESULTS: The pAdeasy system produced a high titer of the recombinant adenovirus ［(1×1013) pfu/L］. When the multiplicity of infection (MOI) was 100, with increasing GCV concentration from 0 up to 50 mg/L, the survival rate of AdKDRtktransfected HUVEC and HepG2 decreased from (90.7±4.5)% and (91.8±4.3)% to (28.9±5.7)% and (75.4±2.9)%, respectively (P<0.01), while the survival rate of AdCMVtktransfected HUVEC and HepG2 declined from 100% to (17.6±2.5)% and (23.2±5.7)%, respectively (P>0.05). Compared with groupⅠ,there was a decrease of tumor weight by (14.7±3.2)% in group III and (23.6±5.6)% in group IV, respectively; and there was a distinct difference between group III and IV (P<0.05). The median MVD was 37.4±8.6，30.6±7.8，27.6±7.1，10.7±4.1 (microvessels/mm2) in group I, II, III and IV, respectively; and there were significent differences between group III and II (P<0.05)，IV and II (P<0.01)，IV and III (P<0.01). CONCLUSION: KDR promoterHSVtk gene may effectually restrain the growth of tumor via targeting angiogenesis of hepatocellular carcinoma with treatment of GCV.

   【Keywords】 liver neoplasms; KDR promoter; gene therapy; herpes Simplex virus thymidine kinase; HepG2 cells; Mice, Balb/c

   【摘要】 目的：探讨KDR为启动子的HSVtk重组腺病毒对肿瘤血管内皮细胞的特异性杀伤效能及机制. 方法：采用pAdeasy系统，构建受KDR启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子调控并可表达HSVtk基因的重组腺病毒，体外分别感染人脐静脉血管内皮细胞系（HUVEC）和肝癌细胞系HepG2，并以MTT法检测其细胞增殖情况. 人肝癌皮下移植瘤裸鼠随机分成更昔洛韦组(I)，空载体病毒组(II)，重组腺病毒CMVtk组(III)及重组腺病毒AdKDRtk组(IV). 各治疗组瘤内分别注入重组腺病毒液及空载体病毒液. 重组腺病毒治疗组在病毒给予24 h后分别ip GCV，连续10 d. 对照组，ip GCV. 观察瘤体大小及免疫组化法定量测定肿瘤微血管密度. 结果：病毒滴度均为1×1013 pfu/L. 感染复数（MOI）为100的条件下， GCV浓度由0增至50 mg/L时感染含AdKDRtk的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率由(90.7±4.5)%和(91.8±4.3)%分别下降至(28.9±5.7)%和(75.4±2.9)%（P<0.01），而感染含AdCMVtk的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率分别下降至(17.6±2.5)%和(23.2±5.7)%（P>0.05）. 体内试验中，与对照组比较，Ⅲ,IV组经治疗后肿瘤的生长均受到了明显的抑制，其抑瘤率分别为(14.7±3.2)%和(23.6±5.6)%（P<0.05）. 组织内的平均血管密度（MVD），Ⅰ组为37.4±8.6，Ⅱ组为30.6±7.8，Ⅲ组为27.6±7.1，IV组为10.7±4.1. 其中，Ⅲ组与Ⅱ组(P<0.05)，IV组与Ⅱ组(P<0.01)，IV组与Ⅲ组(P<0.01)之间比较均有统计学差异. 结论：KDR启动子介导的HSVtk具有特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞的作用.

   【关键词】 肝肿瘤；KDR启动子；基因治疗;重组腺病毒；胸苷激酶系统；HepG2细胞；裸鼠，Balb/c

    0引言

   1971年，Folkman提出肿瘤生长和转移依赖于血管，认为阻断肿瘤血管生成可以成为一种抑制肿瘤生长的方法. 原发性肝癌是一种多血管性的肿瘤，因此，抗血管生成对其的治疗有着尤为重要的意义［1］. 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前所知最重要的血管形成促进因子，能特异地作用于血管内皮细胞，诱导肿瘤的血管形成. KDR(kinase domain insert containing receptor)是VEGF两种高亲和力的酪氨酸激酶受体之一，是VEGF发挥功能的主要受体，它在正常血管内皮细胞中低表达，而在肿瘤血管内皮细胞中高表达［2］. 因而KDR是一个具有高度特异性的肿瘤治疗靶点［3］. 利用KDR启动子在组织中的差异性表达，我们设计由KDR启动子驱动HSVTK基因靶向特异表达于肝癌血管内皮细胞，通过给予GCV可特异地破坏肝癌血管，达到靶向血管治疗肝肿瘤的目的.

   1材料和方法

   1.1材料限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Takara公司及NEC公司. DMEM、胎牛血清、琼脂糖和Lipofectamine2000转染试剂盒购自Gibco公司. 丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)购自Roche公司. 抗KDR抗体、SABCCy3试剂盒及兔抗小鼠CD31多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司. 质粒pBluescriptⅡKDRtk来自于第二军医大学东方肝胆殷正丰教授实验室. 腺病毒系统pAdeasy穿梭质粒ptrack，ptrackCMV及pAdeasy由John Hopkins肿瘤中心Bert Vogelstein教授惠赠. 人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical venous endothelial cells，HUVEC）由广州医学院第一附属医院汤庆博士惠赠. 人胚胎肾细胞系HEK293细胞及肝癌细胞系HepG2由本实验室保存. Balb/c裸鼠购自南方大学动物实验中心.

   1.2方法用XhoⅠ/SalⅠ及XhoⅠ/HindⅢ两组内切酶分别酶切pBluescriptⅡKDRtk，各得到一KDRtk片段和tk片段. 然后将其中的KDRtk及tk片段，分别以相同克隆位点插入到穿梭载体ptrack及ptrackCMV中，构建成ptrackKDRtk与ptrackCMVtk. 用PmeⅠ酶切使穿梭载体ptrackKDRtk和ptrackCMVtk线性化，然后其转化大肠杆菌BJ5183，与其中预先转入的腺病毒载体pAdeasy进行重源重组，分别称为pAdKDRtk和pAdCMVtk. 用线性化(经PacＩ酶切)重组腺病毒AdKDRtk和AdCMVtk质粒分别转染293细胞，操作步骤按Lipofectamine2000产品说明书进行. 尔后，收集细胞，反复冻融，遂收集病毒液. 最后，病毒液离心纯化并检测其滴度.

   1.2.1细胞系血管内皮生长因子受体（KDR）表达的检测将HepG2或HUVEC细胞系的细胞悬液，分别滴于培养皿中的盖玻片上培养4 h. 取出盖玻片，PBS冲洗，再用乙醇固定. 40 g/L多聚甲醛固定，PBS洗涤. 参照SABCCY3试剂盒中的说明书，分别进行KDR抗体免疫组化染色.

   1.2.2体外GCV敏感实验在96孔板中分别接种HUVEC或HepG2细胞(2×103个/孔)，次日加入不同感染复数（multiplicity of infection，MOI） (0，1，10，100)的AdKDRtk或AdCMVtk病毒系列稀释溶液. 培养16 ｈ后,吸尽培养液，实验孔换之以含0，1，10或50 mg/L GCV的新鲜培养液，而对照孔换之以不含GCV的新鲜培养液，37℃继续培养5 d. 采用MTT法检测细胞增殖指数.

   1.2.3Balb/c移植瘤模型的治疗调节瘤细胞悬液浓度为5×1010/L. 每只小鼠左侧腋部皮下接种HepG2细胞0.2 mL（瘤细胞1×107）. 当肿瘤长至100 mm3时，裸鼠随机分成4组（Ⅰ组：GCV；Ⅱ组：空载体病毒；Ⅲ组：pAdCMVTK +GCV；IV组：pAdKDRTK + GCV），每组8只. 治疗组瘤体内分别注入重组腺病毒液及空载体病毒液各0.1 mL，连用2 d. 重组腺病毒液治疗的组在24 h后分别ip GCV100 mg/(kg・d)，连续10 d. 对照组，ip　GCV 100 mg/（kg・d），连续10 d，11 d处死小鼠，取出瘤块，称瘤质量，瘤质量抑制率：抑瘤率=(对照组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%. 另CD31免疫组织化学检测肿瘤微血管密度. 微血管计数的方法采用Weidner方法.

   统计学处理： 结果以x±s表示，采用方差分析比较多组间均数差异，两两比较行LSDt检验，以双侧P<0.05为有统计学意义.

   2结果

   经XhoⅠ/SalⅠ，HindⅢ/XhoⅠ二组酶切后，各显2条片段，分别为2.2 kb和3.0 kb；1.8 kb和3.0 kb，大小及测序结果与提供资料相符（图1）. 重组pAdKDRtk和pAdCMVtk经PacＩ酶切，显示的2个片段大小与预期值(4.5 kb和37.0 kb)一致（图2）. 重组腺病毒质粒转染293细胞后荧光显微镜下可见细胞有GFP表达（图3）. 经3次293细胞内的扩增、CsCl梯度离心后，测定病毒滴度为1×1013 pfu/L. 根据免疫组化染色结果可知，HUVEC免疫组化染色阳性的结果，胞质棕黄染色表达，而空白对照组阴性表达（图4）. HepG2细胞荧光显微镜下未见荧光表现（图5）.

   图1pBluescriptⅡKSKDRtk酶切鉴定图

   图2重组腺病毒质粒pAdKDRtk及pAdCMVtk酶切鉴定图

   图3AdKDRtk感染293细胞GFP的表达SP ×100

   2.1体外GCV敏感试验以不同MOI的AdKDRtk分别转染的HUVEC和HepG2细胞对GCV有不同的敏感性，以MOI=100时最为敏感. 此时，GCV浓度由0增至50 mg/L，感染的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率由(90.7±4.5)%和(91.8±4.3)%分别下降至(28.9±5.7)%和(75.4±2.9)%, 两者比较有统计学差异（表1，P<0.01）.表1pAdKDRtk及pAdCMVtk MOI=100时，不同浓度GCV下HUVEC细胞和HepG2细胞生存率以不同MOI的pAdCMVtk感染的HUVEC和HepG2细胞对GCV均有相似的敏感性. 随着MOI和GCV浓度增加，细胞存活率均呈现明显下降趋势. 当MOI为100时，GCV浓度由0增至50 mg/L时，HUVEC和HepG2细胞存活率分别变为(17.6±2.4)%和(23.2±5.7)%（表1，P>0.05）.

   2.2体内试验Ⅲ，IV组经后肿瘤均有明显的生长抑制，其抑瘤率分别为(14.7±3.2)%和(23.6±5.6)%，而Ⅱ组的抑瘤效果则不明显，为(2.1±0.5)%. Ⅲ，IV组的抑瘤率与Ⅱ组比较均有显著统计学差异（P<0.01），且Ⅲ组与IV组之间的抑瘤率比较有统计学差异(P<0.05).

   2.3肿瘤内微血管密度抗CD31染色肿瘤组织的内皮细胞，在非肿瘤组织中无染色，阳性染色局限于血管内皮细胞的胞质和胞膜，形成条状（纵切面）或环状（横切面）（图６）. 经检测组织内的平均血管密度（MVD）(个/mm2)，Ⅰ组为37.4±8.6，Ⅱ组为30.6±7.8，Ⅲ组为27.6±7.1，IV组为10.7±4.1. 其中，Ⅲ组与Ⅱ组(P<0.05)，IV组与Ⅱ组(P<0.01)，IV组与Ⅲ组(P<0.01)之间的肿瘤内微血管密度比较均有统计学差异，而Ⅰ组与Ⅱ组之间的瘤内血管密度相比较无统计学差异(P>0.05).

   A：空载体病毒组；  B：pAdCMVTK+GCV组；  C：pAdKDRTK+GCV组.

   图6抗CD31免疫组化染色检测各组裸鼠肿瘤组织微血管密度SP ×400

   3讨论

   肿瘤自杀基因疗法要求自杀基因能选择地在靶肿瘤细胞中表达，以最大限度地杀伤肿瘤细胞，最小限度地损伤正常组织. 利用肿瘤特异性基因调控元件可驱动自杀基因仅在特定的肿瘤细胞中表达［4-5］. 血管内皮生长因子受体是肿瘤血管内皮细胞的分子标志，有高度特异性，只在增殖的血管内皮细胞表达，在正常成人内皮细胞上几乎不表达. 与肿瘤细胞相比，内皮细胞具有基因组稳定，不易突变，药物易于到达等优点［6］. KDR通常仅存在于血管内皮细胞和一些肿瘤细胞中，在正常情况下表达水平很低，大多数组织中不能检出［7］. KDR特异地表达于血管内皮细胞，其表达水平与血管内皮细胞更新速度呈正相关. 通常情况下，血管内皮细胞更新缓慢，KDR受体表达很低，肿瘤组织中的血管内皮细胞处于活跃的增殖状态，增殖速度比正常组织血管内皮细胞显著增快，高表达KDR［8］. 因此可以利用KDR启动子调控具有细胞毒性有自杀基因特异性的表达于高度增殖活性的肿瘤血管内皮细胞，而对正常组织血管内皮细胞和其它组织细胞影响较小. Jaggar等利用KDR的以上特点，构建了KDR启动子介导的载体，结果该载体可在血管内皮细胞中靶向表达. 以KDR为靶点进行肿瘤的抑制血管治疗比直接以肿瘤细胞为靶点的治疗具有药物易于到达作用部位、不产生像肿瘤细胞的多药耐药性以及药物广谱性和毒副作用小等优点，虽然肿瘤部位来源的血管类型不同，但受VEGF/KDR信号途径的调控这一点是相同的［9］.

   本研究我们充分利用肿瘤与正常组织中血管内皮间KDR表达的差异性，设计了以KDR启动子调控由腺病毒介导的自杀基因HSVtk转移系统(AdKDRtk)，使其只在肿瘤血管内皮细胞中靶向表达，进而特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞并获较好效果，且采用腺病毒作为目的基因的载体具有滴度高、稳定性好、转基因效率高的优点. 肝癌是一种多血管质的肿瘤，血管新生对其生存、是很重要的. 因此，针对肿瘤血管的生物治疗在肝肿瘤的治疗中具有重要意义.

   【】

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