树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用

作者：张建芳，于文彬，徐修礼，苏明权，马越云，刘家云，丁振若

【关键词】  树突状细胞

　　关键词: 树突状细胞;LAK细胞;免疫

　　摘 要:目的  建立体外培养扩增树突状细胞（DC）的方法，并观察其诱导的抗肿瘤免疫作用. 方法  分离外周血单个核细胞，应用GM-CSF及IL-4诱导DC产生，用TNF-α和PGE2 促进其成熟，并用肺癌细胞系GLC-82可溶性抗原致敏.将成熟DC与自体LAK细胞混合培养（DC-LAK），用MTT法检测DC-LAK细胞及LAK细胞对多种肿瘤细胞系的杀伤作用. 结果  经GM-CSF，IL-4，TNF-α，PGE2 作用后，细胞表达CD1 a阳性率为71.0%，CD83 50.0%，CD14 阳性率低于10.0%，高表达HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ和CD45 ，为典型的DC表型特征.DC-LAK和LAK细胞对4种肿瘤细胞（GLC-82，A549，moser和MCF-7）的杀伤率，前者为84.7%，66.9%，49.3%和56.0%，后者为43.5%，31.3%，45.0%和32.4%. 结论  成功的诱导出具有典型形态特征及增强LAK细胞杀伤活性的DC.
    
　　In vitro generation of human blood dendritic cells for active tumor immunotherapy
    
　　Abstract:AIM To establish a method to culture dendritic cells（DC）in vitro and to observe the anti-tumor effect in-duced by DC.METHODS Dendritic cells were derived from PBMC stimulated with GM-CSF and IL-4and DC were pulsed with tumor soluble antigen abstracted from lung can-cer cell line GLC-82.TNF-αand PGE2 were used to enhance antigen presenting ability of DC.Phenotype of DC were ana-lyzed through FACS.Mature DC were cocultured with LAK cells and the mixed cells were named DC-LAK.Cytotoxicity of DC-LAK and LAK were measured by MTT assay.RESULTS The cultured DC expressed HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱand CD45 and positive rates of CD1 a，CD83 and CD14 were71.0%，50.0%and less than10.0%respectively.Killing rates of DC-LAK and LAK to the four cell lines（GLC-82，A549，moser and MCF-7）were84.7%，66.9%，49.3%，56.0%and43.5%，31.3%，45.0%，32.4%respectively.CONCLUSION DC that have typical phenotype and could be enhance cytotoxity of LAK could be induced from PBMC suc-cessfully.
    
　　0 引言
    
　　近年来树突状细胞（DC）可有效地递呈可溶性肿瘤抗原，增强机体对肿瘤的特异性免疫应答，并在临床取得了成绩［1，2］ .我们将外周血中贴壁的单个核细胞作为DC的前体细胞，联合应用一组细胞因子诱导获得了纯度较高的人树突状细胞，并将之与LAK细胞结合，体外诱导产生了相对高效而特异的抗肿瘤免疫作用.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料 

　　基因重组人IL-4，TNF-α和GM-CSF为Promega公司产品，PGE2 购自Sigma公司，淋巴细胞分离液购自上海医学试剂厂，IL-2为本校基因研究所产品，抗CD1 a-FITC和抗CD83 -FITC购自晶美公司，HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ抗体及羊抗鼠-FITC购自北京邦定公司，酶联免疫检测仪为Labsystem产品;CD14 /CD45 双色荧光标记抗体由西京免疫科提供.肺癌A549为本校基础部免疫学教研室提供;乳腺癌MCF-7细胞引自军事医学院;大肠癌moser细胞、肺癌GLC-82细胞为本室保留株.各细胞系均用含50mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，50mL・L-1 CO2 条件下常规培养.

　　1.2 方法
    
　　1.2.1 肿瘤可溶性抗原提取 

　　收集肿瘤细胞于低渗条件下反复冻融4次，以5000r・min-1 离心30min，取上清，用考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质含量，过滤后冻存备用.    

　　1.2.2 DC及LAK细胞的制备

　　以常规方法分离PBMC，然后用含100mL・L-1 FCS的RPMI1640培养液悬浮，以每孔5×106 个细胞加入6孔板，于37℃，50mL・L-1 CO2 条件下贴壁2h，用预热的培养液轻轻洗出非贴壁细胞，调密度至1×109 ・L-1 ，加IL-2300kU・L-1 ，37℃，50mL・L-1 CO2 条件下培养，每4d换液1次，为LAK细胞.贴壁细胞加完全1640培养液，用100μg・L-1 的GM-CSF及1000U・L-1 的IL-4联合刺激诱导DC分化.DC培养4d，加入GLC-82细胞可溶性抗原100μg・L-1 ，6d加TNF-α（1000kU・L-1 ），PGE2 （10μmol・L-1 ）.10d将DC与LAK细胞混合培养4h，称为DC-LAK.

　　1.2.3 细胞表型分析 

　　收集培养7d的细胞，直接（抗CD14 /抗CD45 ，抗CD1 a和抗CD83 mAb）或间接（抗HLA-I，抗HLA-ⅡmAb）免疫荧光染色后，用流式细胞仪分析.
     
　　1.2.4 体外细胞毒活性测定 

　　以LAK，DC-LAK为效应细胞，以A549，GLC-82，moser和MCF-7为靶细胞，效靶比按10∶1（效应细胞每孔105 个，靶细胞104 个）加入96孔板，另设单独加效应细胞和单独加靶细胞组，每组设3个复孔，置37℃，50mL・L-1 CO2 孵箱中培养16h，用MTT显色，于波长490nm测各孔吸光度（A）值.
    杀伤率（%）=（1-试验孔A-效应细胞A靶细胞A ）×100%.    

　　2 结果
    
　　2.1 DC的制备 

　　DC培养2d即有细胞悬浮，并可看到细胞聚集现象;4d细胞大多呈悬浮生长并聚集成团，可见细胞有毛刺状突起;待加入TNF-α和PGE2 后，细胞逐渐从聚集状态变为分散状态，相差显微镜下可看到细胞表面有大量毛刺状突起，为典型的树突状细胞形态（Fig1）.培养7d DC表达CD1 a阳性率为71.0%，CD83 50.0%，CD14 阳性率低于10.0%，高表达HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ和CD45 ，为典型的DC表型特征（Fig2）.

　　2.2 体外细胞毒实验 

　　效靶细胞混合培养后2h，镜下可看到许多淋巴细胞聚集于肿瘤细胞周围;培养12h后，肿瘤细胞变大，开始溶解;至16h时DC-LAK组大部分肿瘤细胞已溶解，只有一些成团的肿瘤细胞仍存活.DC-LAK与LAK细胞对GLC-82，A549，moser和MCF-7肿瘤细胞的杀伤率，前者为84.7%，66.9%，49.3%和56.0%，后者为43.5%，31.3%，45.0%和32.4%（Fig3）.LAK细胞对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，经特异性肿瘤抗原冲击的DC刺激后，可明显增加LAK细胞的杀伤活性，尤其对GLC-82细胞可产生特异性高效杀伤.
    
　　3 讨论

　　DC是最有效的专职抗原递呈细胞，其在分化发育过程中有两个不同的阶段.未成熟的DC存在于全身非淋巴组织中，具有很强的摄取处理抗原的能力，一旦发育为成熟的DC，捕获抗原的能力即丧失，成为能激活静息T细胞产生初次免疫应答的抗原递呈细胞.在体内，DC含量较少，所以体外大量扩增纯化DC是下一步研究的关键.研究证明骨髓或脐血CD34+ 细胞及外周血单个核细胞可作为DC的来源.GM-CSF和IL-4可诱导其前体细胞向DC分化，TNF-α和PGE2 则可促进其成熟［1-6］ .我们将外周血中的单个核细胞，经GM-CSF和IL-4联合培养，并经TNF-α和PGE2 诱导后生成大量DC，平均收获率约为10.0%，即从107 个PBMC可得106 个DC，并根据其高表达HLA-Ⅰ，HLA-Ⅱ和CD45 以及表达CD1 a和CD
83 的表型特征，结合显微镜所见细胞表面大量毛刺状突起，证实为典型的DC.

　　自Rosenberg等1985年首次报道应用LAK细胞和IL-2肿瘤以来，近十几年来，国内外陆续有报道.该疗法治疗的有效率约为20.0%～35.0%，但需IL-2的剂量大，具有严重的副反应.而且，LAK细胞的治疗属于非特异性的被动免疫治疗.因此，急需寻找抗肿瘤活性高而毒副反应又小的效应细胞.
   
　　我们将肿瘤抗原致敏的DC体外与同源LAK细胞共同培养，诱导产生了具有抗肿瘤活性的DC-LAK细胞.这种细胞在体外不仅具有强大的特异性杀伤作用，而且对同一组织来源的肿瘤细胞也有相对较强的杀伤效应，具有临床应用前景.其优点有:首先，DC具有刺激淋巴细胞增殖的作用，在应用时可以降低IL-2的剂量或不用IL-2，以减轻毒副作用;其次，从一次分离的PBMC中，可用其中的单核细胞培养DC，用淋巴细胞培养LAK细胞，作到合理利用各种成分，不致造成细胞的浪费，降低患者的负担.此外，我们所用的LAK细胞与常规LAK细胞不同，常规LAK细胞为PBMC加IL-2培养，但其中的效应细胞主要为淋巴细胞，PBMC去除贴壁细胞后，主要成分即为淋巴细胞，我们将其作为LAK细胞的来源，在实验中证实与常规LAK细胞无明显差异.

　　:
    
　　［1］Li MS，Yuan AL，Liu SD.Immune response induced by den-dritic cells pulsed with tumor extracts inhibits in vivo growth of implanted tumor and rejects challenge of tumor cells in nude mice ［J］.Zhongliu（Tumor），1999;19（5）:279-285.

    ［2］Wu G，Yu H，Han BL.Dendritic cells acquire antigen from apoptotic hepatochlangioma cells and induce special CTLs ［J］.Mianyixue Zazhi（J Immunol），2000;19（1）:8-12.
   
　　［3］Zitvogel L，Mayordomo JI，Tjandrawan T.Therapy of murine tumors peptide-pulsed dendritic cells:Dependence on T cells，B7costimulation，and T helper cell1-associated cytokines ［J］.
     J Exp Med，1996;183（1）:87-97.
   
　　［4］Thurnher M，Papesh C，Ramoner R.In vitro generation of CD83+ human blood dendritic cells for active tumor immunother-apy ［J］.Exp Hematol，1997;25:232-237.
   
　　［5］Chen BG，Shi YJ，Jeffrey D.The role of tumor necrosis factorαin modulating the quantity of peripheral blood-derived，cy-tokine-driven human dendrtic cella and its role in enhancing the quality of dendritic cell function in presenting soluble antigens to CD
4+ T cella in vitro ［J］.Blood，1998;91（12）:4652-4661.

　　［6］Wang X，Pei XT.Immune adjustment concerned with dendritic cells and it's anti-tumor effects ［J］.Zhongliu（Tumor），1999;19（5）:315-317.