神经营养素受体p75NTR在不同胎龄人胎脑海马中的表达

          作者：王伴青，胡煜辉，廖义林，彭建安，温永顺

【关键词】  神经营养素受体；海马；人胎脑

　　【关键词】 神经营养素受体；海马；人胎脑

    0引言

　　神经营养素是一个高度保守的生长因子家族,包括两种受体: 低亲和力的神经营养素受体p75 (p75 neurotrophin receptor, p75NTR)和高亲和力的Trk. p75NTR是一种Mr为75 000的I型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRⅠ）的成员. 在不同的条件下p75NTR发挥完全不同的生物学效应，一方面它与Trk共表达时，二者结合成杂合二聚体，形成神经营养因子的高亲和性受体，促进神经细胞的存活与生长；另一方面，当p75NTR单独表达时，它能以相同的亲和力与所有的神经营养因子结合而诱导细胞凋亡［1-2］. 海马属边缘系统，与学习记忆、情绪、行为及内脏活动密切相关，在胚胎海马的发育过程中，神经细胞的增殖、分化和凋亡活动非常活跃. 我们通过研究p75NTR在胚胎海马发育过程中的表达及其变化,探讨了p75NTR对神经元发育的影响.

   1材料和方法

   1.1材料收集临床水囊引产胎儿45例(性别不限), 按末次月经时间结合测量顶臀长（Patten法［3］）推算胎龄，按胎龄分成13～16 wk（n=10）、17～20 wk（n=12）、21～24 wk（n=9）、25～28 wk（n=8）、29～32 wk（n=6） 5组. 每例水囊引产胎儿均无神经系统畸形，其母亲均查体健康，由井冈山学院附属和吉安市第一人民医院妇产科经胎儿母亲及家属签字同意后提供. 鼠抗人p75NTR mAb为美国Santa Cruz公司产品，ＳＰ免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购于北京中山生物试剂公司.

   1.2方法

   1.2.1取材、固定及切片水囊引产胎儿娩出后( 均已死亡) 2～3 h内开胸经左心室先以生理盐水灌注冲洗干净后,再以40 g/L多聚甲醛液/0.1 mol磷酸缓冲液灌注固定4 h, 打开头皮及颅骨,撕除脑表面之被膜, 切取海马组织,相同固定液后固定1 wk，经700～1000 mL/L上行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋, 连续切片，切片厚度为8 μｍ,贴于涂有多聚赖氨酸胶的清洁玻璃片上烤干待用.

   1.2.2免疫组化染色(ＳＰ法)采用mAb链菌素亲生物蛋白过氧化物酶(ＳＰ)免疫组化法. 石蜡切片经常规脱蜡后, 清水冲洗，滴加30 g/L过氧化酶阻断剂50 μL,室温30 min,清水冲洗; 0.01 mol/L ＰＢS洗5 min×3次;加10 g/L正常山羊血清50 μL,室温下孵育30 min,吸去多余液体;5组分别滴加鼠抗人p75 mAb（1∶100）（Santa Cruz,USA） 50 μL,4℃的冰箱过夜, 0.01 mol/L ＰＢS洗5 min×3次；加生物素标记二抗（1∶200） 50 μL,室温下1 h， 0.01 mol/LＰＢS洗5 min×3次；加ＳＰ溶液50 μL,室温下1  h，0.01 mol/L ＰＢS洗5 min×3次;加DAB液100 μL,显色5 min后双蒸水冲洗中止反应,脱水、透明、中性树脂封片,光镜下观察. 用0.01 mol/L ＰＢS代替一抗作对照实验，结果为阴性.

   1.2.3图像分析每组每例取3张切片，每张切片在光镜(×400)下阳性细胞分布均匀的部位随机各取5～10个视野,图像经摄像仪输入机,经HMIAS2000高清晰度彩色医学图文分析系统细胞测量程序处理,计算出每组阳性细胞数和总细胞数，再计算出每组样本的阳性细胞百分率.

   统计学处理: 采用SPSS 10.0统计软件中R×C表资料的χ2检验比较组间p75NTR阳性细胞百分率，P<0.05认为有统计学意义.

   2结果

   2.1p75NTR的表达与分布在光学显微镜下观察p75NTR免疫反应阳性产物为棕黄色颗粒，主要定位于细胞质内，部分胞核淡染. 在不同胎龄的切片均可见p75NTR免疫反应阳性细胞. 由于在16 wk前胎儿海马内的神经细胞体积小而圆，细胞核大，胞质少，p75NTR免疫反应产物范围小，部分结构阳性细胞计数较困难.

   在胚胎13～16 wk，海马CA1,CA2,CA3区锥体细胞层内均可见分布着大量小而密集的强染或中等度染色的圆形p75NTR阳性细胞（图1A），随着胎龄的增加，细胞形态由小而圆逐渐变为锥体形. 在紧靠锥体细胞层浅表面的辐射层内也可见排列许多胞体较大、形态与锥体细胞类似、排列松散的p75NTR阳性细胞，并且呈现明显的神经毡染色（图1B）. 17 wk之后的海马齿状回已清晰可辨，可见大量密集排列的阳性颗粒细胞，CA1,CA2及CA3区的阳性锥体细胞密度随胎龄增长而逐渐降低，细胞体积进一步增大，辐射层神经毡染色强度减弱（图1C）. 32 wk时，p75NTR阳性细胞数目明显减少，主要分布于齿状回，在海马CA1区锥体细胞层深部及CA1/CA2交界处可见少量散在分布且染色较弱的大型锥体细胞，其余部位未见或仅见一些微弱染色、轮廓模糊的阳性细胞，辐射层神经毡染色消失(图1D).

   2.2各组p75阳性细胞率比较不同组别胎龄为13～16, 17～20, 21～24, 25～28, 29～32 wk的人胚胎海马p75NTR阳性细胞百分率(%)分别为43.2, 36.8, 25.7, 19.5, 14.3, 阳性细胞百分率随胎龄的增加而呈现降低趋势， 具有显著性的统计学差异（P<0.01）.

   3讨论

　　许多在体和体外实验已经证实［4-6］p75NTR的高表达会导致神经元的死亡（尤其是在中枢神经系统发育阶段），但也有研究表明p75NTR的缺失也会引起感觉神经元数目的大量减少［7-8］. 还有实验证实p75NTR有助于小脑神经细胞和感觉神经Schwann细胞的迁移［9-11］. p75NTR对细胞的存活与死亡的作用及其机制目前仍不明确.

   A: 14 wk胎儿海马CA1区; B: 16 wk胎儿海马CA1区辐射层; C: 19 wk胎儿海马CA2区; D: 32 wk胎儿海马齿状回.

   图1p75NTR的分布SP ×400

   海马是神经干细胞的发源地之一，在胚胎发育过程中海马神经细胞的增殖分化和凋亡活动非常活跃［12-13］. 本实验在各个发育阶段的海马切片中均检测到p75NTR的免疫反应阳性表达细胞，而且在分布部位和形态上存在差异；本研究表明，随着胎龄的增加p75NTR阳性细胞表现出密度降低、数目减少的趋势，与海马神经细胞的总体发育进程相吻合. 在13～16 wk的人胚胎海马中的p75NTR高表达, 而在胎龄32  wk时海马CA1, CA2和CA3等部位未见或仅见一些弱染色、轮廓模糊的大型p75NTR阳性锥体形细胞. 这种结果表明p75NTR主要在未分化和未成熟的神经细胞中高表达，随着海马的发育这些细胞通过迁移和分化而分布于海马各部；而在此过程中，留在发育较早的部位的神经细胞的逐渐发育成熟或凋亡，p75NTR阳性细胞的密度和数目表现为显著的下调. 在胎龄32 wk时齿状回仍存在一定数量的p75NTR阳性细胞，说明在神经系统发育的后期甚至在神经系统发育成熟后齿状回可能仍然存在神经干细胞.

   本研究表明p75NTR主要在神经细胞的早期发育过程中丰富表达，通过一些信号通路调控神经细胞的凋亡与分化.在神经细胞的诱导、增殖、迁移、分化、突触的建立和神经的形成、凋亡等一系列过程中发挥了关键性的生物学效应. 但其作用机制仍有待于进一步研究.

   【】

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