抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白相互作用蛋白编码基因C1的反式调节基因

            作者：蔺淑梅,张树林,成军,刘敏,郭江,张黎颖,杨媛

【关键词】  抑制性消减杂交；反式激活；克隆;,乙型肝炎病毒

   【Abstract】  AIM： To clone and identify human genes transactivated by human gene C1 encoding protein C1 interacting with hepatitis B virus (HBV) core antigen by constructing a cDNA subtractive library with suppression subtractive hybridization (SSH) technique. METHODS： SSH and bioinformatics techniques were used for screening and cloning of the target genes transactivated by C1 protein. The mRNA was isolated from HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-）C1 and pcDNA3.1(-） empty vector, respectively, SSH method was employed to analyze the differentially expressed cDNA sequence between the 2 groups. After restriction enzyme Rsa I digestion, small sizes cDNAs were obtained. Then tester cDNA was divided into 2 groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2, respectively. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent polymerase chain reaction (PCR） twice and then was subcloned into pGEMTeasy plasmid vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E. coli strain DH5α. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with BLAST search after PCR. RESULTS： The subtractive library of genes transactivated by C1 was constructed successfully. Colony PCR of 40 positive clones showed that these clones contained 200-1000 bp inserts. Sequence analysis was performed in 30 clones， at random, and the fulllength sequences were obtained with bioinformatics method. Altogether 18 coding sequences were gotten. CONCLUSION： The obtained sequences may be target genes transactivated by C1 among which some genes coding proteins were involved in cell cycle regulation, metabolism, tumor immunity and development, and initiation and development of liver fibrosis. This finding brought some new clues for studying the biological functions of C1.

   【Keywords】 suppression subtractive hybridization; transactivation; clone; hepatitis B virus

   【摘要】  目的：筛选、克隆与乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原(HBcAg)相互作用的蛋白基因C1的反式激活基因，探索该基因可能的生物学功能. 方法：以分子生物学技术构建C1真核表达载体pcDNA3.1(-)C1, 以表达质粒pcDNA3.1(-)C1转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa I酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应（PCR），将产物与pGEMTeasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选阳性克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果：成功构建人类新基因C1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库. 文库扩增后挑选40个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000 bp插入片段，随机挑选含有插入片段的30个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得18种编码基因. 结论：筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞周期及代谢、肿瘤发生及肝脂肪变及肝纤维化发生发展密切相关的蛋白编码基因，推测了C1在体内可能存在的调控机制的线索.

   【关键词】 抑制性消减杂交；反式激活；克隆; 乙型肝炎病毒

    0引言

   乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBcAg）由乙型肝炎病毒C基因的C区编码的一种结构性蛋白，在HBV的生活周期中，HBcAg,病毒mRNA和DNA聚合酶共同构成核心颗粒，在核心颗粒中完成病毒DNA的合成. HBcAg对于乙肝病毒前基因组RNA的装配、基因组DNA的合成具有重要作用，还与病毒成熟、识别包膜蛋白以及病毒向细胞外释放等过程密切相关［1］. HBcAg特异性CD4+ T细胞免疫应答是清除HBV的重要反应［2］. 我们利用酵母双杂交技术对白细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用的蛋白进行研究，发现了一种能与HBcAg结合的未知功能蛋白，将其编码该蛋白的基因命名为C1，GenBank收录AY555145,利用生物信息学技术确定其开放读码框架（ORF），并对其进行了克隆化研究，顺利得到了C1基因编码序列. 其编码区为366个核苷酸(nt),编码121个氨基酸残基，我们利用抑制性消减杂交技术（SSH）构建C1作用于肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的反式调节cDNA消减文库，筛选差异表达的基因片段，并应用生物信息学进行分析，为进一步了解C1的功能及其探讨HBV感染的发病机制提供理论依据.

   1材料和方法

   1.1材料HepG2细胞及感受态大肠杆菌DH5α为本室保存，pcDNA3.1（-）真核表达载体购自Invitrogen公司；FuGENE6转染试剂购自Roche公司，mRNA Purification试剂盒购自Amersham Pharmacia Biotech公司，PCRSelect cDNA Subtraction试剂盒，50×PCR Enzyme Mix， Advantage PCR Cloning试剂盒购自Clontech公司，High Pure PCR Product Purification试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，T7，SP6通用引物及pGEMTeasy载体购自Promega公司. 真核表达质粒pcDNA3.1(-)c1由本室构建. DNA序列测定由上海联合基因公司完成.

   1.2方法

   1.2.1真核表达载体的细胞转染及mRNA提取用FuGENE6脂质体转染试剂将2 μg的 pcDNA3.1(-)c1及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞，48 h后收获细胞. 使用QuikPreP mico mRNA Purification试剂盒从HepG2细胞中直接提取重组表达质粒及空载体的HepG2细胞的mRNA，经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计分别进行定量分析.

   1.2.2消减杂交文库的建立采用Clontech公司的PCRSelect cDNA Subtraction Kit，常规SSH方法按说明书进行：以转染了重组表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA为模板逆转录合成双链cDNA（dscDNA），并分别标记为Tester和Driver，dscDNA经RsaⅠ（一种识别4碱基序列的内切酶）消化，产生相对较短的平端片段，纯化酶切产物. 将Tester的dscDNA分为两份，分别连接试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2，然后与过量的Driver dscDNA进行杂交；合并两种杂交产物后再与Driver dscDNA作第2次杂交；然后将杂交产物做选择性PCR扩增，使Tester dscDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增.

   1.2.3消减文库扩增及克隆分析扩增产物与pGEMTeasy载体连接，转化DH5α感受态细菌，在含氨苄青霉素的LB/Xgal/IPTG培养板上，37℃培养18 h. 挑取白色菌落，以pGEMTeasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增，证明含有插入片段后（200～1000 bp），随机挑选其中30个克隆增菌、测序. 应用生物信息学将测得序列GenBank数据库进行同源性分析.

   2结果

   2.1mRNA的定性、定量分析紫外分光检测显示，转染了真核表达质粒及空载体的HepG2细胞提取mRNA分别为2.50 μg和2.76 μg，A260 nm／A280 nm=2.1. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳mRNA为大于0.5 kb清晰慧尾片状条带，证实mRNA质量完全满足进行消减杂交的要求.

   2.2dscDNA两端连接效率检测将连接有adaptor 1和adaptor 2的两组dscDNA分别用不同的特异性引物（看家基因甘油三磷酸脱氢酶G3PDH引物）进行28个循环扩增，产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 结果显示两组dscDNA扩增产物浓度相当，说明dscDNA已与接头高效率连接.

   2.3cDNA消减文库消减效率的鉴定以消减及未消减PCR产物为模板，用看家基因G3PDH引物进行PCR扩增，分别在18,23,28,33次循环结束时从体系中吸取5 μL进行电泳鉴定, 结果显示,与未消减组PCR产物相比，消减组PCR产物中G3PDH基因产物大大减少，说明所构建的消减文库具有很高的消减效率(图1).

   2.4差异表达cDNA片段的扩增及克隆杂交产物经两轮PCR扩增后，菌落PCR扩增结果显示为200～1000 bp大小不等的插入片段，所获得的40个克隆中几乎均含有插入片段，这些条带可能代表差异表达的基因片段（图2）.

   M: DNA marker; 1~8: 不同克隆菌落PCR产物电泳结果.

   图2部分克隆菌落PCR鉴定电泳图

   2.5cDNA测序与同源性分析初步结果挑选30个克隆测序，与GenBank数据库进行初步比较(表1).表1阳性克隆与GenBank同源序列比较结果

   3讨论

   SSH方法是近年起来的一项新的基因克隆技术，与传统的方法比较，具有实验周期短、易操作、可靠性高、假阳性率低等特点，能有效地分离扩增低丰度特异表达的基因，可以在较短的时间内获得较理想的实验结果［3 ］.  我们构建真核表达载体pcDNA3.1（-）C1并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，以转染空白载体的相同细胞系作为对照，以2种转染的细胞系中提取的mRNA为起始材料，应用SSH方法成功地构建了C1反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库， 随机挑选文库中30个克隆送测序进行鉴定，结果发现C1可上调一些与细胞周期及代谢、肿瘤发生发展、脂肪代谢有关的基因. 细胞周期及代谢相关蛋白，如人类假定的翻译起始因子，核糖体蛋白，均与蛋白合成有关，泛酰酸激酶（Pank）是CoA生物合成途径中的必需的酶. 肿瘤发生发展及抗肿瘤相关的蛋白，如人类B细胞vrel网状内皮组织增殖病毒癌基因与多种肿瘤的发生有关，可在多种组织激活多种基因转录，如浆液性乳头状瘤、神经母细胞瘤、淋巴瘤，该基因的激活及过量表达则可能导致细胞癌变. 甲胎蛋白（AFP）参与细胞的增殖、代谢的调控以及巨噬细胞和Ｔ淋巴细胞之间的相互作用. 在免疫应答中，认为AFP的作用是免疫抑制，主要表现为抑制母体对胚胎发育的免疫应答以及肿瘤患者对肿瘤的免疫应答，因此AFP的过量表达可能抑制机体的抗肿瘤免疫，与肿瘤发生及发展密切相关［4］. 精胺合成酶与人体内精胺含量相关，精胺合成酶缺乏时，精胺及亚精胺含量减少或测不出，精胺含量与抗肿瘤药的敏感性相关. 精胺缺乏时一些抗肿瘤药［如1,3bis(2chloroethyl)Nnitrosourea］的敏感性显著增加，可见精胺缺乏有利于抗肿瘤药发挥抗肿瘤作用［5］，提示精胺合成酶的过量表达可导致对一些抗肿瘤药物的抵抗或敏感性下降. 一项在日本人群中的研究显示，PCSK9基因变异体可显著影响胆固醇和低密度胆固醇水平［6］. 枯草菌素酶在肝脏是高表达并有助于高胆固醇血症发生［7］. AFP不仅具有免疫抑制作用，运输功能也是其最基本的功能，并且与脂肪代谢有关. 已经证明其最主要的功能之一就是运输脂肪酸, 大部分是不饱和脂肪酸. 资料表明，游离脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸与酒精性和非酒精性脂肪性肝炎的发生和发展密切相关［8］. 范建高的研究提示肝组织内不饱和脂肪酸增多可通过促进产基质细胞（主要是肝细胞）增殖和（或）合成ECM，参与脂肪肝肝纤维化的形成，促进肝纤维化的发生和发展［9］. 本研究结果显示，C1可反式激活AFP及PCSK9基因，使其蛋白表达增加，提示可能与肝脂肪变及肝纤维化发生发展有关.

   【】

   ［1］ Le Pogam S, Shih C. Influence of a putative intermolecular interaction between core and the preS1 domain of the large envelope protein on hepatitis    B virus［J］. J Virol，2002，76:6510-6517.

   ［2］ Riedl P, Stober D, Oehninger C, et al. Priming Th1 immunity to viral coreparticles  is facilitated by trace amounts of RNA bound to its argininerich domain［J］. J Immunol, 2002, 168:4951-4959.

   ［3］ Yang XC， Hao F， Song ZQ, et al. Identification of differentially expressed genes in anagen dermal papilla by suppression subtractive hybridization［J］. Chin Med J, 2004:117(3):371-375.

   ［4］ 辛永宁，宣世英，史光军, 等. 肝癌病人甲胎蛋白水平与T细胞亚群及NK活性的相关性研究［J］. 中华肝胆外科杂志，2005,11(12):851-852.

   ［5］ Ikeguchi Y, Mackintosh CA, McCloskey DE, et al. Effect of spermine synthase    on the sensitivity of cells to antitumour agents［J］. Biochem J, 2003,    373:885-892.

   ［6］ Shioji K, Mannami T, Kokubo Y, et al. Genetic variants in PCSK9 affect the    cholesterol level in Japanese［J］. J Hum Genet,2004,49:109-114.

   ［7］ Abifadel M, Varret M, Rabes JP, et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia［J］. Nat Genet, 2003,34:154-156.

   ［8］ 李夏，袁红娟，赵龙凤，等. 饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸在大鼠脂肪性肝炎与纤维化发生中的作用［J］. 山西职工医学院学报， 2004, 14(4):1-4.

   ［9］ 范建高, 曾民德, 洪健，等.不饱和脂肪酸对L02和HLF细胞增殖及合成细胞外基质的影响［J］. 世界华人消化杂志，1998，6:502-504.